图1 样品的高效液相色谱图
徐红燕，陈赛贞*，徐利君，林利芬
(台州市中心医院药剂科，浙江 台州 318000)
摘要：目的考察依达拉奉软膏体外皮肤渗透性，筛选软膏剂最佳处方。方法以大鼠离体皮肤作为渗透屏障，采用Valin-Chien双室渗透扩散池，以HPLC测定依达拉奉的浓度，考察依达拉奉含量、环糊精的型号和含量以及月桂氮卓酮用量对依达拉奉软膏剂经皮渗透性的影响。结果软膏剂处方的最佳组合为6.0%依达拉奉，8.0%月桂氮卓酮，3.0% β-环糊精，依达拉奉12 h累积渗透量平均值可达(1 215.88±27.59)μg·cm-2，平均渗透速率为(103.69±7.39)μg·cm-2·h-1，结论软膏剂具有较好的皮肤渗透特性，有望成为依达拉奉新的给药剂型。
关键词：依达拉奉；软膏；月桂氮卓酮；环糊精；透皮
急性脑梗塞是心血管内科中较为常见的危急症之一，据报道氧自由基增多是导致急性脑梗死患者脑损伤加重、病情进展的主要原因[1-2]。在其急性期，及时、有效地减少自由基的产生，是治疗脑梗塞的关键。依达拉奉(edarovone，ED)是一种自由基清除剂和脑保护剂，可清除脑缺血周边产生的大量羟自由基，抑制梗塞周围局部脑血流量的减少，升高特异性存活神经细胞的标志物(N-乙酰门冬氨酸)的含量，进而缓解伴随的神经症状，从而削弱神经功能障碍[3-6]。ED对成年和儿童脑梗死患者均有较好的抗神经功能缺损作用，故在临床上得到了广泛的应用[7-9]。目前市售ED制剂仅为注射液，其溶剂丙二醇具有较强的溶血作用，本实验室前期研制的ED凝胶剂透皮性能欠佳[10]，故本实验以ED为主药，应用体外透皮试验仪筛选出月桂氮卓酮、环糊精以及软膏基质的最佳配比，以得到透皮性能最佳的软膏处方。
ED(Sigma，批号：101428045)；月桂氮卓酮(批号：20131115)、白凡士林(批号：20160518)、羊毛脂(批号：20160901)、液体石蜡(批号：20160923)均购自国药集团化学试剂有限公司；α-环糊精(批号：F1417042)、β-环糊精(批号：B1427002)、γ-环糊精(批号：I1324047)均购自阿拉丁试剂有限公司；乙腈(色谱纯，美国天地试剂有限公司，批号：14045024)；其他试剂均为分析纯。
Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Mettler AE200电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；Valia-Chien双室渗透池(自制)；超级恒温循环仪(德国HAAKE)；TG1650WS高速台式离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司)
健康SD大鼠30只，♂，体质量250~300 g，购自浙江省医学科学院实验动物中心，试验动物合格证号：SCXK(浙)2014-0001。
色谱分析柱为Waters symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5µm)；检测波长229 nm；柱温35 ℃；流速1.0 mL·min-1；流动相为乙腈∶超纯水=50∶50；进样量：20 µL。
ED加月桂氮卓酮适量，加环糊精充分研磨，并搅匀，再加凡士林、羊毛脂和液体石蜡，最后将混合物搅匀使之成软膏。
健康SD大鼠处死后，用电动剃须刀剃毛。剥离大鼠背部皮肤，仔细剔除皮下脂肪以及黏连物，剪成适当的大小，-20 ℃冰箱保存，使用前自然解冻。
将自然解冻后的离体大鼠皮肤使用生理盐水浸润，滤纸吸干。绷于Valian-Chien双室渗透池的两室之间，角质层面涂上软膏，真皮层面向接受室，外加一层保护膜，并用配套弹簧夹把渗透池的双口固定，接受池中加入4 mL预热生理盐水。渗透池夹层内水温控制在(32±0.5)℃，池内放置1颗星状搅拌子，电磁搅拌转速为500 r∙min-1。每隔1 h从接受池吸取渗透液1 mL后将接受池内液体吸干，再补加预热生理盐水4 mL，重复以上步骤直至12 h。将取得的待测液以10 000 r∙min-1的转速离心5 min后取上清液，HPLC测定ED含量。
样品按照“1.4”项条件进行含量测定，计算单位时间内ED渗透量，同时计算单位面积内药物累积渗透量Q(μg∙cm-2)，以单位面积累积渗透量(Q)为纵坐标，时间(t)为横坐标作图，得药物累积渗透量曲线，对所得曲线进行回归，求出斜率，即为药物的渗透速率J(μg·cm-2·h-1)。采用SPSS软件进行双样本t检验。
3.1.1 专属性试验 皮肤浸出液(空白)、对照品(皮肤浸出液配制)、体外经皮渗透样品按照“1.4”项色谱条件进行测定，皮肤浸出液杂质与ED分离良好，ED的出峰时间约为4.2 min。HPLC图谱见图1。
图1 样品的高效液相色谱图
A-空白皮肤浸出液；B-对照品溶液(皮肤浸出液配制)；C-体外经皮渗透样品；1-杂质；2-依达拉奉。
Fig. 1 HPLC chromatograms of samples
A-chromatograms of blank skin solution; B-blank skin solution spiked with ED; C-skin permeation solution sample; l-impurity; 2-ED.
3.1.2 标准曲线的制备 精密称取ED对照品112.2 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解至刻度，制成1 122 µg∙mL-1的对照储备液，加入皮肤浸出液配制成质量浓度分别为0.55，1.10，2.19，4.38，8.77，17.53，35.06，70.13，140.25 µg∙mL-1，按“1.4”项下色谱条件进行处理和分析，以峰面积(Y)与相对应的质量浓度(X)作回归曲线，得回归方程为Y=62 747X-36 564，R2=1.0(n=5)，ED在0.55~ 140.25 µg∙mL-1呈良好的线性关系。
3.1.3 准确度和精密度 制备高(105.19 µg∙mL-1)、中(8.77 µg∙mL-1)、低(1.10 µg∙mL-1)3个质量浓度的TMP对照品溶液，按“1.4”项下色谱条件测定，用浓度求算RSD，1 d平行操作5次考察日内精密度和准确度，连续5 d考察日间精密度和准确度，结果日内RSD≤2.2%(n=5)、日间RSD≤6.3% (n=5)，精密度良好，见表1。
表 1 方法准确度和精密度测定结果
Tab. 1 Precision and accuracy for the determination method
经大量预实验后，当存在促进剂月桂氮卓酮，包合剂环糊精，以及软膏基质(白凡士林、羊毛脂、液体石蜡)时，制成的软膏外观良好，而ED含量、促进剂以及辅料含量和比例对药物的经皮渗透性能具有较大影响，所以有必要进一步深入研究。
3.2.1 ED含量对软膏剂渗透性能的影响 以8.0%月桂氮卓酮、3.0% β-环糊精、不同浓度ED制备软膏，考察不同ED含量(5.0%，5.5%，6.0%，6.5%，7.0%，8.0%，10.0%)对ED软膏经皮渗透性能的影响，结果见图2。软膏的累积渗透量在一定范围内随含药量的增加而增大。当含药量增加到6.0%时，其体外累积渗透量达到最大值，当含药量增加到6.5%时，软膏的12 h累积渗透量反而略有下降，与含药量6.0%的相比，具有显著性差异(P<0.05)，推测较大浓度的ED在形成软膏后部分以结晶形式析出，使得软膏的体外累积渗透量反而略有下降，故采用6% ED制备软膏。
图2 ED含量对ED软膏经皮累积渗透量的影响(n=3，
)
Fig. 2 Accumulative permeation amount of ED with different drug concentrations(n=3,)
3.2.2 月桂氮卓酮含量对软膏剂渗透性能的影响以6.0%含药量、3.0% β-环糊精、不同含量月桂氮卓酮制备软膏，考察月桂氮卓酮含量对ED软膏经皮渗透性能的影响，结果见图3。在一定范围内，软膏的累积渗透量随月桂氮卓酮含量的增加而增大。当月桂氮卓酮的含量增加到8.0%时，其体外累积渗透量达到最大，继续增加其含量到9.0%，10.0%后，软膏剂的累积渗透量反而略有下降。月桂氮卓酮的促透作用是通过与相邻极性脂质分子相互竞争氢键、破坏原有氢键，使得细胞间隙扩大，细胞膜表面形成一定大小的孔径，使得细胞膜的流动性增大。8.0%月桂氮卓酮的软膏12 h累积渗透量较9.0%的大，并具有显著性差异(P<0.05)，推测是因为较大浓度的月桂氮卓酮与相邻极性脂质分子相互竞争氢键时的优势减弱，故采用8.0%月桂氮卓酮制备ED软膏。
图3 月桂氮卓酮含量对ED经皮累积渗透量的影响(n=3，)
Fig. 3 Accumulative permeation amount of ED with different percentages of azone(n=3,)
3.2.3 环糊精型号和含量对软膏剂渗透性能的影响 以6.0%含药量、8.0%月桂氮卓酮、3.0%不同型号的环糊精制备软膏，考察不同型号的环糊精对ED软膏体外经皮渗透性能的影响。环糊精因其独特分子囊结构能有效地增加一些水溶性不良的药物的溶解度和溶解速度，并具有提高药物的稳定性和生物利用度的作用，而α、β、γ环糊精分子空洞空隙依次增大。不同型号的环糊精对软膏渗透性能的影响，结果见图4。β-环糊精制备的软膏较α-环糊精和γ-环糊精的12 h累积渗透量大，并有显著性差异(P<0.05)，故采用β-环糊精制备软膏。
图4 环糊精型号对ED经皮累积渗透量的影响(n=3，)
Fig. 4 Accumulative permeation amount of ED with different type of cyclodextrin(n=3,)
以6.0%含药量、8.0%月桂氮卓酮、不同浓度的β-环糊精制备软膏，考察不同浓度的β-环糊精对ED软膏体外经皮渗透性能的影响，结果见图5。3.0% β-环糊精制备的软膏体外累积渗透量最大，较4.0% β-环糊精制备的软膏12 h体外累积渗透量大，并具有显著性差异(P<0.05)。β-环糊精的截锥圆筒腔穴，能够包络ED分子，让药物慢慢地释放出来，继续增加β-环糊精的含量反而没有提高其渗透性能，推测较大含量的β-环糊精对ED起到稳定作用，延长了其释药能力，故采用3.0%的β-环糊精制备软膏。
图5 β-环糊精含量对ED经皮累积渗透量的影响(n=3，
)
Fig. 5 Accumulative permeation amount of ED with different percentages of β-cyclodextrin(n=3,)
ED软膏制备的辅料比例和加入顺序是软膏成型、提高其体外渗透速率的关键，本研究经过大量的预试验，以ED为主药，将其充分研磨后，按一定的顺序依次加入月桂氮卓酮、环糊精，最后加入白凡士林、羊毛脂、液体石蜡的均匀混合物，采用自制的Valin-Chien双室渗透扩散池评价药物的体外经皮渗透性能，筛选出最佳软膏处方，制得均匀稳定的ED软膏剂。
本实验室前期采用羧甲基纤维素钠等辅料将ED研制成了凝胶剂，相较于注射剂给药，ED凝胶剂给药方便，无需专业医护人员，可及时给药，但其体外12 h累积渗透量平均值为(501.95± 27.59)μg·cm-2，为提高急性脑梗塞患者用药的及时有效性，有必要将ED制成透皮性能更好的经皮给药制剂。经过大量试验，笔者得到ED最佳软膏处方为6.0%含药量，8.0%月桂氮卓酮，3.0% β-环糊精和白凡士林、羊毛脂、液体石蜡的均匀混合物，其体外12 h累积渗透量平均值可达(1 215.88± 27.59)μg·cm-2，较ED凝胶剂的高近1倍。
国外研究者分别研究了ED口腔黏膜给药、口服给药情况[11-12]，但当患者病情发作，面部肌肉僵直难以吞咽，意识模糊时，药物将难以及时、有效地完成给药，这对于控制患者病情是不利的。研究者还对ED直肠给药制剂进行了研究，但其生物利用度只为口腔黏膜给药的26.6%。本试验以软膏为载体将ED制成透皮给药系统，由于其制备工艺简单，成本低廉而具有较大的生产优势。相较于注射剂和口服制剂而言，软膏剂给药方便，针对脑梗塞等心脑血管性疾病来说，更具有研究意义。
REFERENCES
[1] OKAMURA K, TSUBOKAWA T, JOHSHITA H, et al. Edaravone, a free radical scavenger, attenuates cerebral infarction and hemorrhagic infarction in rats with hyperglycemia [J]. Neurol Res, 2014, 36(1): 65-69.
[2] YAMAMOTO Y. Plasma marker of tissue oxidative damage and edaravone as a scavenger drug against peroxyl radicals and peroxynitrite [J]. J Clin Biochem Nutr, 2017, 60(1): 49-54.
[3] YUAN Q F, LI X X, ZHANG J P, et al. Therapeutic effect, nerve function, CRP level analysis of butylphthalide and sodium chloride injection combined with edaravone in the treatment of new-onset cerebral infarction [J]. Chin J New Drugs(中国新药杂志), 2017, 26(23): 2818-2821.
[4] DAI B, YAN T, SHEN Y X, et al. Edaravone protects against oxygen-glucose-serum deprivation/restoration-induced apoptosis in spinal cord astrocytes by inhibiting integrated stress response [J]. Neural Regen Res, 2017, 12(2): 283-289.
[5] MIYAMOTO N, PHAM L D, MAKI T, et al. A radical scavenger edaravone inhibits matrix metalloproteinase-9 upregulation and blood-brain barrier breakdown in a mouse model of prolonged cerebral hypoperfusion [J]. Neurosci Lett, 2014(573): 40-45.
[6] IKEDA K, IWASAKI Y. Edaravone, free radical scavenger, delayed symptomatic and pathological progression ofmotor neuron disease in the wobbler mouse [J]. PLoS One, 2015, 10(10): e0140316.
[7] NAKAMOTO H, AIHARA Y, YAMAGUCHI K, et al. Efficacy, safety, and outcomes in 17 pediatric cases treated with the free radical scavenger edaravone [J]. Childs Nerv Syst, 2015, 31(9): 1533-1540.
[8] ZHANG D Y, KANG S S, ZHANG Z W, et al. Edaravone enhances the viability of ischemia/reperfusion flaps [J]. J Huazhong Univ Sci Technol Med Sci, 2017, 37(1): 51-56.
[9] SHINOHARA Y, INOUE S. Cost-effectiveness analysis of the neuroprotective agent edaravone for noncardioemboliccerebral infarction [J]. J Stroke Cerebrovasc Dis, 2013, 22(5): 668-674.
[10] XU H Y, chens Z, XU L J, et al. Preparation and in vitro permeation of edaravone transdermal gel [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2016, 33(6): 752-755.
[11] SATO T, MIZUNO K, ISHII F. A novel administration route of edaravone--II: mucosal absorption of edaravone from edaravone/hydroxypropyl-beta-cyclodextrin complex solution includingL-cysteine and sodium hydrogen sulfite [J]. Pharmacology, 2010, 85(2): 88-94.
[12] Parikh A, Kathawala K, Tan C C, et al. Development of a novel oral delivery system of edaravone for enhancing bioavailability [J]. Int J Pharm, 2016, 515(1/2): 490-500.
Prescription Screening andin Vitropermeation of edaravone transdermal ointment
XU Hongyan, chensaizhen*, XU Lijun, LIN Lifen
(Department of Pharmacy, Taizhou Central Hospital, Taizhou 318000, China)
ABSTRACT:OBJECTIVETo investigate thein vitroskin permeability of edaravone ointment and screen its best prescription.METHODSThe skin permeation ability was evaluated by Valian-Chien permeation cells with isolated rat skin. The concentration of edaravone in samples was determined by HPLC, so as to investigate the effect of edaravone content, cyclodextrin type, cyclodextrin content, and azone dosage on its skin permeation ability.RESULTSThe best combination of ointment prescription was composed with 6.0% edaravone, 8.0% azone and 3.0% β-cyclodextrin. The accumulative permeation amount of the ointment was (1 215.88±27.59)μg·cm-2 in 12 h，and the permeation rate was (103.69±7.39)μg·cm-2·h-1.CONCLUSIONOintment has good skin penetration properties and is expected to be a new dosage form for edaravone.
KEY WORDS:edaravone; ointment; azone; cyclodextrin; transdermal
中图分类号：R944.2+1
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2018)09-1295-04
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.09.005
引用本文：徐红燕, 陈赛贞, 徐利君, 等. 依达拉奉软膏的处方筛选及体外透皮性能研究[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(9): 1295-1298.
收稿日期：2017-12-11
基金项目：浙江省医药卫生科技计划项目(2018KY181)；台州市科技计划项目(162yw02-2)；浙江省医学会临床科研资金项目(2013ZYC-A133)；台州恩泽医疗中心(集团)科研基金项目(14EZD1)
作者简介：徐红燕，女，硕士，主管药师 Tel: (0576)88526219 E-mail: rabbit_chinese@163.com
*通信作者：陈赛贞，女，主任药师 Tel: (0576)88526219 E-mail: tzcsz@126.com
(本文责编：曹粤锋)