图1 黄杞苷的结构式(A)和棍状模型(B)
Fig. 1 The structure (A) and stick model (B) of engeletin
谢雨露，黄毓珧，李熙灿*
(广州中医药大学中药学院，广州 510006)
摘要：目的研究黄杞苷保护DNA氧化损伤的活性与可能机制。方法采用DNA保护分析法、超氧自由基(·O2-)清除法、Ferrozine显色法，探讨其保护DNA氧化损伤的活性与可能机制，并通过紫外可见光谱(UV-vis spectra)考察其与Fe2+络合的变化。结果在DNA保护分析法、·O2-自由基清除法、Ferrozine显色法中，黄杞苷在一定浓度范围内，表现出浓度依赖性。其IC50值分别(60.3±9.9)，(44.5±7.6)，(159.7±19.9)μg·mL-1。UV-vis光谱分析表明，黄杞苷与Fe2+混合后，在波长475 nm处出现新的峰，摩尔消光系数为102.5 L·mol-1·cm-1。结论黄杞苷能较好地保护DNA，免受羟基自由基(·OH)诱导的氧化损伤。其保护作用由直接清除ROS和间接清除ROS 2个途径实现。黄杞苷直接清除ROS，可能与氢转移和电子转移有关；间接清除ROS可能通过络合Fe2+的方式，阻断·OH自由基生成。不过，受3-位鼠李糖基的空间位阻影响，其Fe2+络合能力较弱。
关键词：黄杞苷；自由基；DNA氧化；Fe2+络合；机制
DNA氧化损伤可以导致细胞(尤其是干细胞)的氧化应激[1]，引发基因突变、癌变，以及神经退行性病变[2-3]。DNA氧化损伤是由活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)进攻DNA的碱基或脱氧核糖骨架而引起的。ROS的典型代表，是具有极强攻击力的羟基自由基(·OH)。如果·OH自由基进攻DNA中的鸟嘌呤碱基，则生成鸟嘌呤碱基自由基(如2’-deoxyadenosine-5’-monophosphate radical，dAMP)[2]，进一步生成8-羟基-2’-脱氧鸟嘌呤核苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine，8-OHdG)。所以，检测血液或尿液中的8-OHdG水平，可用于糖尿病、动脉粥样硬化和肿瘤等多种疾病的风险评估[4]。如果·OH自由基进攻脱氧核糖骨架，则可以生成丙二醛(malondialdehyde，MDA)等产物[2-3]。
无论是dAMP·自由基、8-OHdG、还是MDA，都是细胞氧化应激的毒性产物。因此，寻找合适的抗氧化剂使DNA免受氧化损伤，减少这些毒物的产生，成为自由基生物医学的一项重要研究内容。而从具有数千年历史的中药中，挖掘天然抗氧化剂，更引发了相关学者的浓厚兴趣。
笔者的前期研究表明，中药的天然抗氧化成分主要是多酚。虽然多糖也有一定的效果，但远逊于多酚[5]。中药多酚有黄酮及黄酮苷[2,6-7]、类黄酮[8]、酚酸及其酯[9]、双黄酮[10]、挥发酚[3]、咖啡酰奎宁酸[11]等。其中以黄酮及黄酮苷最常见。
黄杞苷实际上是二氢山柰酚的鼠李糖苷，它是中药黄杞(Engelhardia roxburghianaWall.)的主要成分之一[12-13]，结构见图1。目前，已有一些零星的报道，提示黄杞苷具有抗氧化活性[14-15]。不过，专门针对抗氧化活性评价及机制探讨的研究，尚未见报道。
本研究拟通过DNA保护分析法、超氧自由基(·O2-)清除法和金属离子络合法，测定黄杞苷对DNA氧化损伤的保护作用，并进一步探讨其可能机制。
图1 黄杞苷的结构式(A)和棍状模型(B)
Fig. 1 The structure (A) and stick model (B) of engeletin
UV2100可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；BS110S电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)；TDL80-2B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；SB3200D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；pH计(YSI)。
黄杞苷(CAS：572-31-6；四川省维克奇生物科技有限公司，批号：20150709A；纯度：98%)；Ferrozine(CAS：69898-45-9；批号：SLBP4832V；纯度：98%)、Trolox(CAS：53188-07-1；批号：BCBL1374V；纯度：97%)均购自Sigma公司；鱼精DNA钠盐(CAS：100403-24-5；批号：0042C387)均购自美国Amresco公司；KH2PO4(AR)、Na2HPO4·12H2O、Na2EDTA、FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、30%H2O2、抗坏血酸、柠檬酸钠(AR，广州化学试剂厂)；三氯乙酸(AR，天津市大茂化学试剂厂)；2-硫代巴比妥酸(AR，齐云生物科技有限公司)；乙醇、甲醇均为分析纯。
·OH自由基是人体在新陈代谢过程中产生的对生物体毒性最强、危害最大的1种自由基，具有很强的氧化性[6]，可损伤DNA等生物分子。而本实验以DNA为底物，探讨黄杞苷对·OH自由基诱导的DNA损伤的保护作用[2]。取黄杞苷溶液(2.0 mg·mL-1)xmL(x=12，24，36，48，60，72)于离心管中，置于60 ℃水浴锅挥干溶剂，往离心管加入350 µL磷酸盐缓冲液(0.2 mol·L-1，pH 7.4)、25 µL Na2EDTA溶液(80 µmol·L-1)、3 µL FeCl3·6H2O溶液(25 µmol·L-1)、3 µL H2O2溶液(2.8 mmol·L-1)、25 µL鱼精DNA钠盐(2.8 mmol·L-1)，超声5 min，加入3 µL抗坏血酸溶液(0.1 mmol·L-1)，置于50 ℃水浴锅加热20 min后，再加入250 µL三氯乙酸溶液和250 µL 2-硫代巴比妥酸溶液，置于115 ℃烘20 min，在532 nm下测定A值。实验以Trolox (2.0 mg·mL-1)为阳性对照，平行测定3次取平均值。清除率计算公式为：
其中A0为未加样品时的吸光度；A为加入样品反应后的吸光度。
·O2-自由基是带负电的氧分子，2个氧以单键相连，具有很强的氧化性。本实验用连苯三酚自氧化法产生·O2-自由基[16]。取490 μL Tris-HCL缓冲液(0.1 mol·L-1，pH 7.4)放入比色皿，加入10 μL连苯三酚(60 mmol·L-1，含1 mmol·L-1盐酸)，迅速混合(颠覆式)，每隔30 s读数1次，至300 s时为止，此时的ΔA=ΔA0(ΔA=A325 nm,300 s-A325 nm,30 s)。另取黄杞苷溶液(0.5 mg·mL-1)xmL(x=12，24，36，48，60，150)加入比色皿中，加(490-x)μL Tris-HCl缓冲液，再加10 μL连苯三酚溶液，迅速混合(颠覆式)，开始计时，每隔30 s测量1次，至300 s时为止。此时的ΔA=ΔA样。实验以Trolox(0.5 mg·mL-1)为阳性对照，平行测定3次取平均值。清除率计算公式[17]：
黄杞苷的Fe2+络合能力依据文献报道进行测定[11]。在FeCl2·4H2O(250 μmol·L-1)溶液中加入150 μL甲醇充分混合，置于37 ℃水浴锅水浴加热30 min后，依次加入37 μL甲醇、38 μL Ferrozine溶液(500 μmol·L-1)，静置5 min，测A值(562 nm)，此A值为A0值。取黄杞苷溶液(1 mg·mL-1)xmL(x=30，60，90，120，150)，再加(150-x)μL甲醇、25 μL FeCl2溶液，充分混合，置于37 ℃水浴锅水浴加热30 min后，依次加入37 μL甲醇、38 μL Ferrozine溶液，静置5 min，测A值(562 nm)。实验以柠檬酸钠(1 mg·mL-1)为阳性对照，平行测定3次取平均值。计算公式：
其中A0为未加样品时的吸光度；A为加入样品反应后的吸光度。
取100 μL黄杞苷(1 mg·mL-1)和100 μL的FeCl2·4H2O(10 mg·mL-1)溶液加入液相瓶中，加甲醇至1 mL。溶液充分混合后倒入比色皿，放入紫外分光光度计进行扫描，每10 min扫描1次，扫描范围是200~800 nm。1 h后放入96孔板观察颜色的变化[18]。
通过线性回归分析来计算IC50值。线性相关系数用Origin 6.0软件经线性拟合(Fit Linear)分析而得。测定样品平均IC50值的显著性用SPSS 13.0单因素方差分析的t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
在保护DNA实验中，黄杞苷在一定浓度范围内，随着样品浓度的增加，保护能力相应增加，结果见图2，表1。说明黄杞苷对·OH引起的DNA损伤有保护作用。在清除·O2-自由基实验中，黄杞苷的清除能力呈现出剂量依赖性且是Trolox的4.6倍，说明黄杞苷清除·O2-自由基的能力很强。由O2+e-→·O2-，·O2-+e-→H2O2反应式可知，清除·O2-的同时间接清除了·OH，黄杞苷是清除·OH的天然抗氧化剂，也表明黄杞苷在体外有直接清除ROS的能力[10]。
由以上结果知黄杞苷清除ROS的能力很强，笔者推测与其结构上的羟基数量和位置有关[19]，由图1知黄杞苷在5位、4’位和7位都有酚羟基。进一步推测，黄杞苷可能通过酚羟基与自由基反应，生成稳定的半醌自由基，从而中断链式反应。
如图3所示，Fe2+溶液和黄杞苷与二者的反应液做对比，在波长475 nm出现新的峰，反应液的颜色由无色变为淡粉色，推测黄杞苷与Fe2+发生了络合，反应液颜色比较浅，可能是黄杞苷只有4-羰基- 5-羟基的结合位点。据此，笔者推测其络合反应见图4[20]。
图2 黄杞苷对自由基的清除作用与络合Fe2+能力(n=3,
)
A-·OH自由基清除试验；B-·O2-自由基清除试验；C-Fe2+络合试验。
Fig. 2 Scavenging effect on free radicals and the ability to combine Fe2+of engeletin (n=3,)
A-·OH-scavenging assay; B-·O2--scavenging assay; C-Fe2+-binding assay.
表1 黄杞苷与阳性对照(Trolox)的IC50值
Tab. 1 The IC50values of engeletin and Trolox in various antioxidant assays
注：与Trolox相比，1)P<0.05；与柠檬酸钠相比，1)P<0.05。
Note: Compared with Trolox,1)P<0.05; compared with sodium citrate,2)P<0.05.
图3 黄杞苷与Fe2+的UV扫描图
Fig. 3 UV spectra of engeletin and Fe2+
黄杞苷有一定的金属络合能力，其Fe2+络合的位点在4-羰基-5-羟基之间。不过，其Fe2+络合能力比柠檬酸钠弱(表1，图2C)。这可能是受3-位鼠李糖基的空间位阻所致。
黄杞苷直接清除ROS的机制可能发生了氢转移和电子转移[21]。Fe2+络合的机制可能是黄杞苷的4-羰基-5-羟基结构与金属离子能形成稳定的五元环或六元环[22]。在H2O2通过Fenton反应变成·OH的过程中，Fe2+就是反应物之一，黄杞苷能与Fe2+络合间接阻断生成·OH，从而达到间接清除活性氧的效果。
图4 黄杞苷与铁反应的可能结合位点
Fig. 4 Proposed reaction of engeletin binding to Fe2+
黄杞苷有较强的保护DNA氧化损伤的能力。黄杞苷保护DNA氧化损伤的能力是由直接清除ROS和间接清除ROS(即Fe2+络合)来实现的，其Fe2+络合的位点在4-羰基-5-羟基之间。受3-位鼠李糖基的空间位阻影响，黄杞苷的Fe2+络合能力较弱。
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Protection Effect of Engeletin Towards DNA Against Oxidative Damage and Its Possible Mechanisms
XIE Yulu, HUANG Yuyao, LI Xican*
(School of Pharmaceutical Sciences, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)
ABSTRACT:OBJECTIVETo study engeletin’s protective effect towards DNA against oxidative damagein vitro,and further to explore the possible mechanisms.METHODSProtective effect of engeletin was measured using DNA protection assay, ·O2--scavenging assay, and Fe2+-binding colorimetry assay. Its Fe2+-binding were also analyzed by UV-vis spectra.RESULTSIn the DNA protection assay, ·O2--scavenging assay, and Fe2+-binding colorimetry assay, engeletin increased the percentages dose-dependently, and the IC50values were (60.3±9.9), (44.5±7.6), (159.7±19.9) μg·mL-1, respectively. When engeletin mixed with Fe2+, there was a new peak at 475 nm with molar extinction coefficient 102.5 L·mol-1·cm-1in UV-vis spectra.CONCLUSIONEngeletin can effectively protect DNA from oxidative damage induced by ·OH. The protective effect may be fulfilled through direct ROS-scavenging which is via electron-transfer (ET) and H+-transfer (HAT) pathways, and indirectpathway (i.e. Fe2+-binding to blocking ·OH-production). However, its Fe2+-binding reaction is sterically hindered by the huge rhamnose residue at 3-position.
KEY WORDS:engeletin; free radical; DNA oxidative damage; Fe2+-binding; mechanism
中图分类号：R285.5
文献标志码：A
文章编号：1007-7693(2018)09-1333-04
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.09.014
引用本文：谢雨露, 黄毓珧, 李熙灿. 黄杞苷保护DNA氧化损伤的活性及其可能机制[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(9): 1333-1336.
收稿日期：2017-11-21
基金项目：国家自然科学基金项目(81573558)；广东省科技计划项目(2017A050506043)
作者简介：谢雨露，女，硕士生 Tel: 15521418607 E-mail: xieyulu1900@163.com
*通信作者：李熙灿，男，博导 Tel: 13725245780 E-mail: lixican@126.com
(本文责编：李艳芳)