图1 高效液相色谱图
邓俊杰
(绍兴市食品药品检验研究院，浙江 绍兴 312088)
摘要：目的建立HPLC双波长法同时测定炎热清片中龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素6种成分的含量。方法采用Agilent TC-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶0.2%磷酸水溶液(梯度洗脱)，柱温为35 ℃，流速为1.0 mL·min-1，检测波长0~20 min为254 nm，同时检测龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷，20~50 min为280 nm，同时检测黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素。结果龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素分别在18.92~189.2 ng(r=0.999 9)，107.44~1 074.4 ng(r=0.999 9)，9.82~98.2 ng(r=0.999 9)，767.68~7 676.8 ng(r=1.000 0)，100.94~ 1 009.4 ng(r=0.999 9)，49.84~498.4 ng(r=0.999 9)线性良好，平均回收率(n=9)分别为98.31%，98.35%，98.40%，98.03%，98.46%，98.24%，RSD分别为0.4%，0.3%，0.3%，0.4%，0.4%，0.3%。结论该方法灵敏、简便、准确，可用于炎热清片的质量控制。
关键词：炎热清片；龙胆苦苷；栀子苷；芒果苷；黄芩苷；黄芩素；汉黄芩素；高效液相色谱法
炎热清片现行标准为国家药品监督管理局国家标准YBZ13632005-2011Z-5，处方由龙胆、栀子、知母、黄芩、玄参、石膏、柴胡、薄荷脑8味中药组成，具有解表清里、清热解毒的功效。临床用于呼吸道炎、支气管炎、肺炎、急性扁桃体炎，也可用于泌尿系统感染、胆道感染[1-3]。
目前，国家标准YBZ13632005-2011Z-5中只以黄芩苷1种成分作为指标考察制剂质量，既缺少对以黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素为代表的总黄酮含量的研究，也缺少对处方中其他组分药材的质控指标，整体质量的控制尚显不足。本实验采用HPLC双波长法同时测定龙胆主要成分龙胆苦苷，栀子主要成分栀子苷，知母主要成分芒果苷，黄芩主要成分黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素，从1种成分的检测到同时检测6种成分，较大幅度地提升整体质量标准，经验证该方法灵敏、简便、准确，可用于炎热清片的质量控制[4-15]。
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；UV-2550型紫外可见分光光度计(岛津仪器有限公司)；XPE 105电子天平(Mettler Toledo梅特勒-托利多公司)；FESCO17微量离心机(Termo赛默飞世尔科技公司)；KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)。
龙胆苦苷(批号：110770-201314；含量以100.0%计)，栀子苷(批号：110749-201316；含量以97.5%计)，芒果苷(批号：111607-201503；含量以98.4%计)，黄芩苷(批号：110715-201318；含量以93.3%计)，黄芩素(批号：111595-201607；含量以98.5%计)，汉黄芩素(批号：111514-201605；含量以100.0%计)均购自中国食品药品检定研究院；乙腈(色谱纯，美国天地试剂公司)；磷酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；超纯水；炎热清片(吉林天药本草堂制药有限公司，批号分别为150304，160509，160704)。
色谱柱：Agilent TC-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.2%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0~15 min，12%A；15~ 42 min，12%→15%A；42~50 min，50%→12%A)；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：0~20 min为254 nm，20~50 min为280 nm，进样量：10 μL。
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取①龙胆苦苷对照品9.46 mg，置于100 mL量瓶中；②栀子苷对照品11.02 mg，置于20 mL量瓶中；③芒果苷对照品12.47mg，置于250 mL量瓶中；④黄芩素对照品12.81 mg，置于25 mL量瓶中；⑤汉黄芩素对照品12.46 mg，置于50 mL量瓶中，分别加70%甲醇溶解并稀释至刻度，作为对照品贮备液。再精密称取黄芩苷对照品20.57 mg，置于50 mL量瓶中，加入①~⑤号对照品储备液各5.0 mL，加70%甲醇稀释至刻度，制成混合对照品溶液，龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量分别为9.46，53.72，4.91，383.84，50.47，24.92 μg·mL-1(含量均已计算相应纯度)。
2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量，除去包衣，研细，混匀，精密称取0.5 g，置50 mL量瓶中，加入70%甲醇40 mL，超声处理30 min，取出，放冷至室温，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，离心，取续滤液，即得。
2.2.3 阴性供试品溶液制备 按处方组成及生产工艺，分别制备缺龙胆、栀子、知母、黄芩的4种阴性供试品，再按供试品溶液制备法制得阴性供试品溶液。
分别取对照品溶液、供试品溶液和4种阴性供试品溶液各10 μL，按“2.1”项下色谱条件注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果供试品色谱图中显示与对照品相同保留时间的色谱峰，且各色谱峰分离度均>1.5，阴性供试品溶液在此保留时间无色谱峰出现，表明处方中其他成分对结果无干扰，该方法系统适应性良好，结果见图1。
图1 高效液相色谱图
A-混合对照品；B-供试品；C-缺龙胆阴性供试品；D-缺栀子阴性供试品；E-缺知母阴性供试品；F-缺黄芩阴性供试品；1-龙胆苦苷；2-栀子苷；3-芒果苷；4-黄芩苷；5-黄芩素；6-汉黄芩素。
Fig. 1 HPLC chromatogram
A-mixed reference substances; B-sample; C-negative sample without Gentiance Radix et Rhizoma; D-negative sample without Gardeniae Fructus; E-negative sample without Anemarrhenae Rhizoma; F-negative sample without Scutellariae Radix; 1-gentiopicroside; 2-geniposide; 3-mangiferin; 4-baicalin; 5-baicalein; 6-wogonin.
分别精密量取混合品对照品溶液2，4，8，12，16，20 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰而积。以峰面积为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)绘制标准曲线，计算得线性回归方程，结果见表1。
表1 6种成分的线性回归方程
Tab. 1 The regression curve of six components
取“2.2.1”项下对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，每次进样10 μL，连续进样6次，记录色谱峰面积，结果龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.3%，0.1%，0.3%，0.2%，0.2%，0.4%，表明仪器精密度良好。
取6份同一批号供试品粉末(批号：160704)，以供试品溶液制备法制备，按“2.1”项下色谱条件测定并计算，结果龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量分别为0.779，5.41，0.491，41.6，5.01，2.53 mg·g-1，RSD分别为0.3%，0.1%，0.5%，0.4%，0.3%，0.2%，表明重复性较好。
取同一供试品溶液，分别在0，8，12，24，48 h，按“2.1”项下色谱条件测定并计算，结果龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素在不同时间点测得含量的RSD分别为0.3%，0.5%，0.6%，0.4%，0.5%，0.4%，表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.8.1 加标用对照品溶液的制备 精密称取①龙胆苦苷对照品20.24 mg；②芒果苷对照品12.72 mg，③汉黄芩素对照品64.32 mg分别置于10 mL量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，作为①、②、③储备液。再精密称取栀子苷对照品13.97 mg，黄芩苷对照品112.56 mg，黄芩素对照品12.87 mg，置于同一20 mL量瓶中，加入①、②、③储备液各1.0 mL，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，制成加标用对照品溶液，龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量分别为0.101 2，0.681，0.062 6，5.251，0.634，0.321 6 mg·mL-1。
2.8.2 加样回收率测定 取9份已知含量的同一批号供试品粉末(批号：160704)，每份约0.25 g，精密称定，分置具塞锥形瓶中，3份为1组，分别加入加标用对照品溶液1.0，2.0，3.0 mL(约相当于样品含量的50%，100%，150%)，以供试品溶液制备法制备，按上述色谱条件测定，并计算回收率，结果见表2。3组不同对照品加入量(n=9)间的平均回收率，龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素分别为98.31%，98.35%，98.40%，98.03%，98.46%，98.24%，RSD分别为0.4%，0.3%，0.3%，0.4%，0.4%，0.3%。
取3批供试品(150304，160509，160704)粉末各约0.5 g，精密称定，以供试品溶液制备法制备，按“2.1”项下色谱条件测定并计算含量，结果见表3。
表2 加样回收率试验测定结果(n=9)
Tab. 2 Results of recovery test(n=9)
表3 供试品含量测定结果(n=3)
Tab. 3 Results of sample determination(n=3) mg·g-1
参考中国药典2015年版一部和相关文献，确定各组分常用流动相的选择如下：龙胆苦苷为甲醇∶水(25∶75)，栀子苷为乙腈∶水(15∶85)，芒果苷为乙腈∶0.2%冰醋酸(15∶85)，黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素为甲醇∶0.2%磷酸(47∶53)。故流动相的选择可以分为2组：龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷3者为1组，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素3者为1组，2组流动相的洗脱能力相差较大，故采用梯度洗脱的方法。
比较甲醇和乙腈作为有机相的分离效果，由于龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷3者结构类似，甲醇分离效果优于乙腈，最终以甲醇作为有机相，同时在水相中添加0.2%的磷酸，有效改善各组分的峰型。
取龙胆苦苷、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对照品适量，分别加 70%甲醇溶解后，使用紫外可见分光光度计分别测定紫外光谱图，结果各组分的最大吸收波长分别为：龙胆苦苷254，270 nm，栀子苷238 nm，芒果苷241，258，318 nm，黄芩苷213，278，315 nm，黄芩素214，275，322 nm，汉黄芩素199，275 nm。流动相中甲醇在190~220 nm处有吸收，考虑在避免干扰的同时，使各组分均有较高响应值，最终确定检测波长0~20 min为254 nm，20~50 min为280 nm。
取用甲醇、乙醇、70%甲醇作为提取溶剂，分别制备供试品溶液，结果发现用70%甲醇作为溶剂提取效果好，杂质峰较少，故选用70%甲醇作为提取溶剂。
比较了超声和回流2种提取方法，发现提取效果差异小，相同提取时间下，含量基本相同，考虑提取过程中，超声法比回流法溶剂挥发量少，结果重复性好，故选择超声提取法。
比较了超声时间20，30，45，60 min对结果的影响，结果在超声时间20 min时，黄芩苷含量偏低，未能完全提取，30，45，60 min下，各组分含量基本相同，故选择超声时间为30 min。
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Simultaneous Determination of Six Components in Yanreqing Tablets by Double-wavelength HPLC
DENG Junjie
(Shaoxing Institute for Food and Drug Control, Shaoxing 312088, China)
ABSTRACT:OBJECTIVETo establish a new double-wavelength HPLC method for simultaneous determination of 6 main components in Yanreqing tablets.METHODSThe method was performed on an Agilent TC-C18column(4.6 mm×250 mm, 5 μm). The mobile phase was consisited of methanol-0.2% phosphoric acid by gradient elution at 35 ℃ column temperature. The flow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was 254 nm for gentiopicroside, geniposide , mangiferin at 0-20 min, and 280 nm for baicalin, baicalein, wogonin at 20-50 min.RESULTSGentiopicroside, geniposide, mangiferin, baicalin, baicalein, wogonin showed a good linear relationship in the range of 18.92-189.2 ng(r=0.999 9), 107.44-1 074.4 ng(r=0.999 9), 9.82-98.2 ng(r=0.999 9), 767.68-7 676.8 ng(r=1.000 0), 100.94-1 009.4 ng(r=0.999 9), 49.84-498.4 ng(r=0.999 9), respectively. The average recoveries were 98.31%, 98.35%, 98.40%, 98.03%, 98.46%, 98.24%, the RSD were 0.4%, 0.3%, 0.3%, 0.4%, 0.4%, 0.3%.CONCLUSIONThe method is sensitive, simple, accurate, and suitable for the quality control of Yanreqing tablets.
KEY WORDS:Yanreqing tablets; gentiopicroside; geniposide; mangiferin; baicalin; baicalein; wogonin; HPLC
中图分类号：R927.2
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2018)09-1329-04
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.09.013
引用本文：邓俊杰. HPLC双波长法同时测定炎热清片中6种有效成分的含量[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(9): 1329-1332.
收稿日期：2017-11-08
作者简介：邓俊杰，男，硕士 Tel: (0575)89101355 E-mail: 79761822@qq.com
(本文责编：曹粤锋)