图1 小儿咳喘灵颗粒HPLC色谱图
姚晓1，蒋骊龙2，陈建伟3*
(1.常州市食品药品监督检验中心，江苏 常州 213002；2.中国药科大学，南京 211198；3.南京中医药大学药学院，南京 210023)
摘要：目的采用HPLC同时测定小儿咳喘灵颗粒中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、(R,S)告依春、绿原酸、苦杏仁苷、甘草苷、木犀草苷、甘草酸的含量。方法采用双波长HPLC，以Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)进行分离；流动相：0.1%磷酸水溶液-乙腈梯度洗脱；流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；检测波长210 nm(盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、木犀草苷)，245nm[(R,S)告依春、绿原酸、甘草酸]。结果8种成分的峰面积与质量浓度的线性关系良好，加样回收率96.23%~100.7%。结论该方法简便、快速、准确，可用于小儿咳喘灵颗粒的质量控制。
关键词：小儿咳喘灵颗粒；盐酸麻黄碱；盐酸伪麻黄碱；(R,S)告依春；双波长；高效液相色谱法；含量测定
小儿咳喘灵颗粒是由麻黄、金银花、苦杏仁、板蓝根、石膏、甘草、瓜蒌等7味中药组成的复方制剂，具有宣肺、止咳及平喘的作用，用于上呼吸道感染、气管炎、肺炎、咳嗽等症[1]。盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱是麻黄的主要有效成分，同时是属于需要控制的毒、麻类成分，而且本品主要适宜人群为儿童，所以控制麻黄的用量显得尤其重要[1-3]。金银花中的绿原酸和板蓝根中的(R,S)-告依春是其中清热解毒、抗病毒、抗炎的主要活性成分，甘草苷是甘草中化痰平喘的重要指标成分，苦杏仁苷是苦杏仁中止咳、抗炎的重要指标成分，木犀草苷具有较强的止咳、祛痰、平喘的作用[2-4]。现有的小儿咳喘灵颗粒标准中，《卫生部药品标准》(中药成方制剂第四册WS3-B-0688-91)中无含量测定项；国家药品监督管理局标准(WS3-B-0688-91-9)中仅有绿原酸单一成分的含量测定方法。制剂中多指标含量检测是中药质量标准现代化的必然要求。目前，该制剂中(R,S)-告依春、绿原酸和甘草苷3种成分的同时测定已有报道[1]，但尚未见同时测定其盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、(R,S)告依春、绿原酸、苦杏仁苷、甘草苷、木犀草苷、甘草酸8种有效成分的报道。本研究采用HPLC-DAD检测器，双波长，流动相梯度洗脱，同时测定了这8种有效成分的含量，为该复方制剂多指标成分含量测定提供了依据。
LC-20A型高效液相色谱仪，SPD-M20A二极管阵列检测器，LC Solution化学工作站(日本SHIMADZU)；XP105DR型电子分析天平(十万分之一，梅特勒)；KQ300DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
小儿咳喘灵颗粒[四川恩威制药有限公司，国药准字：Z20054893；规格：每袋2 g；批号：151208；葵花药业集团(伊春)有限公司，国药准字：Z23022188；规格：每袋2 g，批号：20151203；三金集团湖南三金制药有限责任公司，国药准字：Z43020247；规格：每袋2 g，批号：141201]。
阴性样品制备药材均购自市场，均经常州市食品药品监督检验中心中药科李莉副主任中药师鉴定为正品。
对照品：盐酸麻黄碱(批号：171241-201007，含量99.7%)、盐酸伪麻黄碱(批号：171237-201510，含量100.0%)、(R,S)告依春(批号：111753-201505，含量100.0%)、绿原酸(批号：110753-201415，含量96.2%)、苦杏仁苷(批号：110820-201607，含量90.7%)、甘草苷(批号：111610-201106，含量93.7%)、木犀草苷(批号：111720-201408，含量94.9%)、甘草酸铵(批号：110731-201619，含量93.0%)均购自中国食品药品检定研究院。
其他试剂：磷酸为分析纯，乙腈为德国默克色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流动相：0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0~20 min，7%B；20~28 min，7%→14%B；28~30 min，14%→20%B；30~40 min，20%→30%B；40~45 min，30%→75%B；45~60 min，75%B)；后运行时间：8 min；柱温：30 ℃；流速：1 mL·min-1；检测波长：210 nm(盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、苦杏仁苷、甘草苷、木犀草苷)及245 nm[(R,S)告依春、绿原酸、甘草酸]；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，HPLC图谱见图1。
图1 小儿咳喘灵颗粒HPLC色谱图
1-盐酸麻黄碱；2-盐酸伪麻黄碱；3-(R,S)告依春；4-绿原酸；5-苦杏仁苷；6-甘草苷；7-木犀草苷；8-甘草酸；A1、A2-混合对照品；B1、B2-样品；C1、C2-缺麻黄的阴性样品；D1、D2-缺板蓝根的阴性样品；E1、E2-缺金银花的阴性样品；F1、F2-缺苦杏仁的阴性样品；G1、G2-缺甘草的阴性样品。
Fig. 1 HPLC chromatography of Child Kechuanling granules
1-ephedrine hydrochloride; 2-pseudoephedrine hydrochloride; 3-(R,S)-goitrin; 4-chlorogenic acid; 5-amygdalin; 6-liquiritin; 7-luteoloside; 8-glycyrrhetic acid；A1, A2-mixed reference substances; B1, B2-sample; C1, C2-negative sample without Herba Ephedrae; D1, D2-negative sample without Isatidis Radix; E1, E2-negative sample without Lonicerae Japonicae Flos; F1, F2-negative sample without Armeniacae Semen Amarum; G1, G2-negative sample without Glycyrrhizae Radix et Rhizoma.
分别精密称取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、(R,S)告依春、苦杏仁苷、甘草苷、木犀草苷、甘草酸铵的对照品22.36，10.88，9.22，11.11，10.45，10.73，9.94 mg，加50%甲醇溶解并定容于量瓶中，分别制成单一成分对照品储备液；取绿原酸的对照品16.16 mg，精密称定，加50%甲醇溶解并定容于棕色量瓶中，制成单一成分对照品储备液。分别取精密量取各对照品储备液适量，加甲醇定容制得混合对照品溶液[盐酸麻黄碱89.44 mg·L-1、盐酸伪麻黄碱43.52 mg·L-1、(R,S)告依春9.220 mg·L-1、绿原酸606.0 mg·L-1、苦杏仁苷416.6 mg·L-1、甘草苷146.3 mg·L-1、木犀草苷80.48 mg·L-1、甘草酸铵260.9 mg·L-1]。
取小儿咳喘灵颗粒，研细，精密称取1.0 g，置50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇约40 mL，超声处理30 min，放冷，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
按工艺方法制备缺麻黄、金银花、苦杏仁、板蓝根、甘草的阴性样品，分别按“2.3”项下方法操作，制成阴性样品溶液。
分别精密移取“2.2”项下对照品溶液3，5，10，15，20，25 mL置于50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。按“2.1”项下的色谱条件，分别进样 10 μL，记录峰面积。以峰面积Y为纵坐标，进样量X(μg)为横坐标，进行线性回归，得回归方程。结果见表1。
表1 回归方程、相关系数和线性范围
Tab. 1 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges
注：*甘草酸重量=甘草酸铵重量/1.0207。
Note:*weight of Glycyrrhizic acid = weight of ammonium glycyrrhizate/1.0207.
精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次测定，记录峰面积。结果显示盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、(R,S)告依春、绿原酸、苦杏仁苷、甘草苷、木犀草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为0.52%，0.52%，0.57%，0.57%，0.65%，0.58%，1.55%和0.55%，表明仪器精密度良好。
取同一份供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，10 h按“2.1”项下色谱条件测定峰面积，盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、(R,S)告依春、绿原酸、苦杏仁苷、甘草苷、木犀草苷和甘草酸峰面积的RSD分别为1.00%，1.97%，1.83%，1.79%，1.80%，0.99%，2.09%和1.91%，结果表明供试品溶液在10 h内稳定。
取同一批样品(批号为151208)6份，照“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下色谱条件下分别进样测定。结果显示样品中的盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、(R,S)告依春、绿原酸、苦杏仁苷、甘草苷、木犀草苷和甘草酸平均质量分数(n=6)分别为0.844 5，0.409 6，0.090 51，6.125，3.944，1.494，0.808 4和2.617 mg·g-1；RSD分别为1.65%，0.89%，1.05%，1.95%，1.39%，1.80%，2.27%和2.23%，结果表明方法重复性良好。
取9份已测知含量的样品(批号为151208)颗粒适量，研细，精密称取约0.5 g置50 mL棕色量瓶中，分别按相当于样品中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、(R,S)告依春、绿原酸、苦杏仁苷、甘草苷、木犀草苷和甘草酸含有量的80%，100%，120%加入各对照品(不同加入量各3份)，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，测定含量，并计算加样回收率和RSD。盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、(R,S)告依春、绿原酸、苦杏仁苷、甘草苷、木犀草苷和甘草酸平均回收率(n=9)分别为98.82%，98.75%，100.2%，98.01%，98.92%，99.84%，100.7%，96.23%，RSD分别1.43%，1.26%，1.92%，1.95%，1.22%，1.96%，1.23%，1.70%。结果见表2。
取3批不同厂家、不同批号的小儿咳喘灵颗粒，各3份，照“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1”项色谱条件分别进样测定，外标法计算含量。结果见表3。
表2 8种成分的回收率试验结果(n=9)
Tab. 2 Results of recovery tests in eight constituents(n=9)
表3 小儿咳喘灵颗粒样品中8种成分的含量测定结果(n=3)
Tab. 3 Contents of eight components in the sample of Child Kechuanling granules(n=3) mg·g-1
考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液乙腈-0.02%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸溶液(含0.1%三乙胺)等流动相系统，结果发现甲醇-0.1%磷酸水溶液流动相使得系统压力明显高于乙腈-0.1%磷酸水溶液，而且乙腈比甲醇有更好的洗脱能力，各成分峰形较好，达到满意的分离。三乙胺有毒，具强刺激性，加入效果不显著；在流动相中加入0.1%磷酸水溶液作为改性剂，分离效果得到了更好的改善。最终，选择了乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相。
采用高效液相的DAD检测器分别对8个对照品在200~400 nm处进行扫描，结果发现盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、绿原酸、苦杏仁苷、甘草苷在210 nm处有较强紫外吸收，(R,S)告依春、木犀草苷、甘草酸在245 nm处有较强紫外吸收，因此选择检测波长为210，245 nm。
考察了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、稀乙醇、70%乙醇等不同溶剂超声和回流提取，并考察了不同提取时间(30，45，60 min)的提取效率。实验结果表明加热回流与超声处理样品，两者提取的各物质含量相差不大，从操作简便角度考虑，确定提取方法为超声提取；结果各组分均在50%甲醇条件下达到最大提取率，并且超声30与60 min的差异无统计学意义。故本实验选用50%甲醇溶液超声提取30 min。
目前小儿咳喘灵颗粒标准中单一成分的含量测定方法很难达到复方制剂质量控制的要求，本品为儿童用药，在药品有效性和安全性方面更应慎重，因此，对小儿咳喘灵颗粒建立全面、有效的质量控制方法十分必要[5-6]。本研究建立的方法能同时测定小儿咳喘灵颗粒中盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、(R,S)告依春、绿原酸、苦杏仁苷、甘草苷、木犀草苷和甘草酸的含量，方法简便、可靠，重复性好，可用于小儿咳喘灵颗粒的多指标质量控制。
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(本文责编：李艳芳)
Simultaneous Determination of Eight Effective Components in Child Kechuanling Granules by Double Wavelength HPLC
YAO Xiao1, JIANG Lilong2, CHEN Jianwei3*
(1.Changzhou Food and Drug Administration, Changzhou 213002, China; 2.China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China; 3.College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China)
ABSTRACT: OBJECTIVETo establish an HPLC method for determine the contents of ephedrine hydrochloride, pseudoephedrine hydrochloride, epigoitrin, chlorogenic acid, amygdalin, liquiritin, luteoloside and glycyrrhetic acid in Child Kechuanling granules at the same time.METHODSA double wavelength HPLC method was performed. The chromatographic separations were achieved on a Agilent ZORBAX SB-C18column(4.6 mm×250 mm, 5 μm). The mobile phase of acetonitrile and 0.1% phosphoric acid solution was used with a gradient elution.The flow rate was 1.0 mL·min-1and the column temperature was 30 ℃. The detector wavelength was 210 nm for ephedrine hydrochloride, pseudoephedrine hydrochloride, amygdalin, liquiritin and luteoloside and 245 nm for (R,S)-goitrin, chlorogenic acid and glycyrrhetic acid.RESULTSEight constituents were seperated perfectly and good linear relationships were obtained. The recoveries were between 96.23%-100.7%.CONCLUSIONThe method is reliable, simple and accurate, and can be used for the quality control of Child Kechuanling granules.
KEY WORDS:Child Kechuanling granules; ephedrine hydrochloride; pseudoephedrine hydrochloride; (R,S)-goitrin; double wavelength; HPLC; content determination
中图分类号：R927.2
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2018)07-1036-05
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.07.020
基金项目：江苏高校优势学科建设工程资助项目(YSXK-2010)
作者简介：姚晓，男，硕士，主管药师 Tel: (0519)86629692 E-mail: 462956308@qq.com
*通信作者：陈建伟，男，硕士，教授，博导 Tel: (025)85811280 E-mail: chenjw695@126.com
收稿日期：2017-10-13
引用本文：姚晓, 蒋骊龙, 陈建伟. 双波长HPLC同时测定小儿咳喘灵颗粒中8种有效成分的含量[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(7): 1036-1040.