图1 制剂中蒲公英TLC图谱
祝宇，张晓燕，骆霞，周灿，魏娟*
(湖北医药学院附属人民医院药学部，湖北 十堰 442000)
摘要：目的建立复方肤清洗剂内控标准，使临床用药更合理安全。方法采用薄层色谱法(TLC)对方中的蒲公英、赤芍进行定性鉴别；采用高效液相色谱法同时测定复方肤清洗剂中芍药苷、异绿原酸A、咖啡酸的含量。色谱条件：Inertsil ODS-SP色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈-0.02%磷酸水溶液(11∶89)，流速为1.2 ml·min-1，检测波长为230，323 nm。结果在TLC中能检出赤芍、蒲公英的特征斑点；芍药苷、异绿原酸A和咖啡酸分别在14.06~225，7.5~120，2.5~40 µg·ml-1内与峰面积线性关系较好，相关系数分别为0.999 9，0.999 8，0.999 7，加样回收率的平均值分别为94.5%，98.6%，99.2%，RSD分别为0.98%，1.66%，0.65%(n=6)。结论所建立的TLC鉴别方法简单、准确，且HPLC含量测定方法专属性强，可用于复方肤清洗剂的质量控制。
关键词：复方肤清洗剂；薄层色谱法；高效液相色谱法；芍药苷；异绿原酸A；咖啡酸；质量标准
复方肤清洗剂是十堰市人民医院名老中医的经验方，全方由赤芍、蒲公英、金银花、当归、滑石等10味中药材组成，可用于风热湿毒所致的湿疹、过敏性皮炎的治疗。
本处方中以清热凉血、散瘀止痛的赤芍[1]为君药，以清热解毒、散结消痈的金银花[2]和蒲公英[3]为臣药。故本实验采用薄层色谱法对方中的蒲公英、赤芍进行定性鉴别；采用HPLC同时测定方中芍药苷[4]、异绿原酸A[5]、咖啡酸[6]的含量，为复方肤清洗剂质量标准的建立提供实验依据。
LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津)；FA2004万分之一电子分析天平(上海天平仪器厂)；KWY-10恒温干燥箱(武汉市武昌实验仪器厂)；STARTER 2100通用pH计(美国Ohaus)；硅胶G预制板(10 cm×20 cm，山东青岛海洋化工厂)。
蒲公英对照药材(批号：121195-200902)、赤芍对照药材(批号：120995-200503)；对照品芍药苷、异绿原酸A、咖咖酸(批号分别为110736- 201438，110853-201426，110885-200102，纯度分别为99.9%，99.7%，99.9%)均购自中国食品药品检定研究院；复方肤清洗剂(十堰市人民医院制剂室，批号分别为20160920，20161014，20161123，20161218，20170125)；乙腈、甲醇为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为屈臣氏纯净水。
2.1.1 蒲公英薄层鉴别 取3批复方肤清洗剂(批号：20160920，20161014，20161123)各10 ml，加稀盐酸调至pH 2~3，用乙酸乙酯萃取2次，分取乙酸乙酯液，合并酯层并浓缩至1 ml，作为供试品溶液。取蒲公英对照药材1 g，加水30 ml，回流提取1 h，放冷，按上述方法制成蒲公英对照药材溶液。取缺蒲公英药材的阴性样品，同法制得蒲公英阴性对照溶液。分别吸取3 μL上述3批供试品溶液、阴性对照溶液和5 μL的对照药材溶液，点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶4∶1)混合溶剂为展开剂展开，取出，晾干，喷以1%三氯化铝乙醇溶液显色，置室温下晾干。在紫外光灯(365 nm)下检视，在薄层色谱板上，蒲公英对照药材与供试品有对应的斑点，且蒲公英阴性对照无干扰，见图1。
图1 制剂中蒲公英TLC图谱
1-阴性对照；2-对照药材；3-供试品(批号：20160920)；4-供试品(批号：20161014)；5-供试品(批号：20161123)。
Fig. 1 The TLC chromatogram of dandelion
1-negative control; 2-control; 3-sample(batch No.20160920); 4-sample (batch No.20161014); 5-sample(batch No.20161123).
2.1.2 赤芍薄层鉴别 取批号分别为20160920，20161014，20161123的3批复方肤清洗剂各10 ml，用正丁醇10 ml萃取，合并浓缩至1 ml，作为供试品溶液。取赤芍对照药材0.5 g，加水50 ml，回流提取1 h，放冷，按上述方法制成赤芍对照药材溶液。取缺赤芍药材的阴性样品，同法制得赤芍阴性对照溶液。分别吸取15 μL上述3批供试品溶液、阴性对照溶液和3 μL的对照药材溶液，点于同一薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(40∶5∶10∶0.2)混合溶剂为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，置烘箱，加热105 ℃至斑点清晰，放于日光灯下检视。在薄层板上，赤芍对照药材与供试品有对应的斑点，且赤芍阴性对照无干扰[7]，见图2。
图2 制剂中赤芍TLC图谱
1-阴性对照；2-对照药材；3-供试品(批号：20160920)；4-供试品(批号：20161014)；5-供试品(批号：20161123)。
Fig. 2 The TLC chromatogram of Paeoniae Rubra Radix
1-negative control; 2-control; 3-sample(batch No.20160920); 4-sample (batch No.20161014); 5-sample(batch No.20161123).
2.2.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SP柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.02%磷酸水溶液(11∶89)；流速：1.2 mL·min-1；检测波长： 230，323 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
2.2.2 混合对照品溶液的制备 取芍药苷、异绿原酸A、咖啡酸对照品适量，精密称定，分别用25 ml量瓶定容，超声处理10 min，过 0.45 μm微孔滤膜，置于5 ℃冰箱中备用。量取绿原酸、咖啡酸、芍药苷对照品溶液适量，配制成质量浓度分别为60，10，56 μg·mL-1的混合对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 用移液管吸取复方肤清洗剂样品10 ml，用饱和正丁醇萃取3次(20，20，20 ml)，合并萃取液，水浴蒸干，残渣用50%的甲醇溶液定容至10 ml量瓶中，精密吸取5 ml，定容至10 ml量瓶中，摇匀，过微孔滤膜(0.45 μm)，取续滤液，即得。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 按照处方比例分别称取除赤芍、金银花、蒲公英以外的其他各味药材，按复方肤清洗剂制备工艺进行提取，制得阴性制剂。按“2.2.3”项下方法制得阴性对照溶液。
2.2.5 专属性考察 精密吸取混合对照品溶液、复方肤清洗剂(批号：20160920)样品溶液、阴性对照品溶液10 μL注入高效液相色谱仪进行测定。色谱峰结果显示，对照品溶液和供试品溶液3种成分的保留时间一致，且阴性对照品溶液无干扰，表明该方法专属性良好，见图3。
图3 复方肤清洗剂高效液相色谱图
A-混合对照品溶液；B-供试品溶液；C-缺金银花样品溶液；D-缺蒲公英样品溶液；E-缺赤芍样品溶液；1-异绿原酸A；2-咖啡酸；3-芍药苷。
Fig. 3 HPLC chromatogram of Fufang Fuqing lotion
A-reference substance; B-sample; C-sample without Lonicerae Japonicae Flos; D-sample without dandelion; E-sample without paeoniae rubra radix; 1-isochlorogeni acid A; 2-caffeic acid; 3-paeoniflorin.
2.2.6 线性考察 分别精密称取混合对照品适量，制成不同浓度的对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，以峰面积(Y)为纵坐标、进样质量(X，µg)为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线。结果见表1。
表1 芍药苷、异绿原酸A、咖啡酸线性回归方程
Tab. 1 The linear relationship of peaoniflorin, isochlorogenic acid A and caffeic acid
2.2.7 仪器精密度试验 取“2.2.2”项下制备的混合对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6次，计算芍药苷、异绿原酸A、咖啡酸峰面积的RSD分别为0.95%，1.32%，0.97%，表明仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性试验 取复方肤清洗剂(批号：20160920)制备的供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析。分别于0，2，4，8，12，24 h进样，计算芍药苷、异绿原酸A、咖啡酸峰面积的 RSD 分别为0.68%，1.24%，1.10%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.2.9 重复性试验 取复方肤清洗剂( 批号：20160920)，按“2.2.3”项下方法配制6份供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样。记录各数据，计算芍药苷、异绿原酸A、咖啡酸的平均含量分别为54.38，49.90，5.49 μg·ml-1；RSD 分别为0.96%，1.42%，1.53%，重复性符合要求。
2.2.10 加样回收率试验 取复方肤清洗剂(批号：20160920)，精密加入适量绿原酸、咖啡酸、芍药苷，平行6份，按“2.2.3”项下方法制成加样回收供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件测定，记录数据并计算。结果见表2。
2.2.11 供试品含量测定 取批号为20160920，20161014，20161123，20161218，20170125的5批复方肤清洗剂各1瓶，按“2.2.3”项下方法配制样品，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，结果见表3。根据上述测定结果，拟定本品中芍药苷、异绿原酸A、咖啡酸的含量分别不得少于43.48，39.89，4.32 μg·ml-1作为含量控制指标较为合理。
表2 加样回收率试验结果(n=6)
Tab. 2 The results of recovery tests(n=6)
表3 复方肤清洗剂含量测定结果(n=3)
Tab. 3 The determination results of Fufang Fuqing lotion (n=3)
中药含量测定方法和内容是中药质量可控性的重要标准。现行大多数中药成方制剂中的含量测定指标选择易得、易测的指标，指标的选择及其限度的象征性意义大于质控实际意义[8]。在复方肤清洗剂质量标准研究中，笔者加强了对含量测定指标代表性的研究，选择处方中起主要作用的君药和臣药的有效成分为测定指标，对质控水平的提高意义重大。
中药复方制剂的质量标准含量测定项目中，含量测定的方式具有多样性的特点，多组分(多指标)测定的代表性应高于单一成分的含量测定。在复方肤清洗剂质量标准研究中，本实验以芍药苷、异绿原酸A和咖啡酸3种化学成分为中心，采用多指标成分定量分析方法，达到全面控制复方肤清洗剂质量的目的。
REFERENCES
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(本文责编：曹粤锋)
Study on Quality Standard for Fufang Fuqing Lotion
ZHU Yu, ZHANG Xiaoyan, LUO Xia, ZHOU Can, WEI Juan*
(Department of Pharmacy of Renmin Hospital, Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China)
ABSTRACT: OBJECTIVETo establish the internal control standard of Fufang Fuqing lotion, which makes the clinical medicine more reasonable and safe.METHODSdandelion and paeoniae rubra were identificated by TLC. Simultaneous determination of paeoniflorin, isochlorogeni acid A and caffeic acid in Fufang Fuqing lotion by HPLC. The samples of Fufang Fuqing lotion were separated on Inertsil ODS-SP column(4.6 mm×250 mm, 5 μm). The mobile phase was set as acetonitrile-0.02% phosphoric acid(11∶89), and the flow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength were set at 230 and 323 nm.RESULTSIn TLC could be detected paeoniae rubra radix and dandelion characteristics of the spots. The calibration curves of peaoniflorin, isochlorogenic acid A and caffeic acid showed a good linear relationship over the range of 14.06-225 µg·ml-1(r=0.999 9), 7.5-120 µg·ml-1(r=0.999 8) and 2.5-40 µg·ml-1(r=0.999 7). The average recovery rate were 94.5%, 98.6%, 99.2% with RSD 0.98%, 1.66%, 0.65%.CONCLUSIONThe established TLC identification method is simple, accurate, and the content of HPLC method is specific, which can be used for quality control of Fufang Fuqing lotion.
KEY WORDS:Fufang Fuqing lotion; TLC; HPLC; peaoniflorin; isochlorogenic acid A; caffeic acid; quality standard
中图分类号：R284.1；R917.101
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2018)07-1046-04
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.07.022
引用本文：祝宇, 张晓燕, 骆霞, 等. 复方肤清洗剂质量标准研究[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(7): 1046-1049.
基金项目：2017 年十堰市科学技术研究与开发项目(17K73)
作者简介：祝宇，男，硕士，药师 Tel: (0719)8637625 E-mail: fireflieszhuyu@163.com
*通信作者：魏娟，女，硕士，药师 Tel: (0719)8637251 E-mail: 247314073@qq.com
收稿日期：2017-08-31