蛛网膜下腔出血(subarach-noid hemorrhage，SAH)是一种非常严重的脑血管疾病，在我国多见于40岁以上女性，男女比例约为2∶3，每年至少有 30 000例新发患者[1]。SAH可有脑血管痉挛(cerebral vasospasm，CVS)、脑积水、再出血、抽搐等并发症，其中CVS最为常见，是致残和致死的主要原因，大约有 20%～30%的 SAH患者出现CVS，导致缺血性脑损伤，并可继发脑梗死，因此必须对其进行积极治疗[2-3]。发生CVS后，缺血加速细胞凋亡、坏死，导致严重的临床结局，病死率非常高[4]。研究发现[5]，在 SAH后损耗了大量的内源性降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide，CGRP)，这个过程参与了SAH后CVS。因外源性 CGRP是大分子，不易透过血脑屏障，限制了其在SAH后预防CVS中的应用[6-8]。本研究利用大鼠 SAH模型，观察经鼻靶向给予CGRP对 SAH后海马组织凋亡因子 Bcl-2、caspase-3的蛋白表达影响，探讨经鼻靶向中枢给予CGRP对CVS所致缺血损伤的保护作用。
1 材料与仪器
1.1 试剂与材料
肝素钠注射液(山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号：151009067A；规格：12 500 IU∶2 mL)；CGRP(美国 Sigma公司，批号：20090324914)；SABC-FITC免疫荧光试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司，批号：2010010263264)；冰冻切片包埋剂(美国 Sakura公司，OCT)；Bcl-2、caspase-3多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司，批号：201001064238)；PBS粉剂(北京中杉生物技术有限公司)。
1.2 仪器
51600型脑立体定位仪(美国Stoelting公司)；320222YHBA01型微量注射器(无锡市东风玻璃仪器厂)；Milli-Q型超纯水机(法国Millipore公司)；Radiance 2100型激光共聚焦显微镜(美国Bio-Red公司)；CM1900型冰冻切片机(德国 Leica设备有限公司)；DHL-A 型电脑数显恒流泵(上海泸西分析仪器厂)；BX51型荧光显微镜(日本Olympus公司)。
1.3 动物
SPF级Wistar大鼠，♂，体质量为(270±20)g，8～10周龄，来自山东鲁抗实验动物中心，动物生产合格证号：SCXK(鲁)2010-0017。
2 方法
2.1 动物分组与模型制作
将 48只 Wistar大鼠随机分为正常对照组、SAH组、生理盐水(NS)+SAH组、CGRP+SAH组，每组12只。除正常对照组外，其余采用枕大池2次注血法建立SAH模型[9]。
2.2 经鼻给药方法
SAH模型制作成功后，NS+SAH组、CGRP+SAH组大鼠经10%的水合氯醛麻醉，取仰卧位，分别经鼻给予NS和新鲜配制的CGRP(1 000 μg的CGRP用NS稀释至1 000 μL，每次给药5 μL，共给药10次，20 min内完成给药总量为50 μL)。
2.3 组织固定和标本制作
各实验组于术后72 h，4%的多聚甲醛溶液灌注固定后，断头取脑继续固定12 h，依次放入20%和30%的蔗糖溶液梯度脱水。OCT包埋、液氮速冻、-80 ℃冰箱冻存备用。取预处理后的脑组织标本，做厚度为8 μm的冰冻切片。
2.4 Bcl-2、caspase-3蛋白表达检测
取出切片复温30 min，丙酮固定10 min，用PBS浸洗3次；滴加0.1% TritonX-100室温静置20 min，PBS浸洗3次；滴加50 μL 10%山羊血清封闭30 min，弃封闭液，滴加Bcl-2或caspase-3一抗 50 μL(为兔抗大鼠多克隆抗体，稀释比例为1∶50)，置于湿盒中 4 ℃过夜；将切片室温放置30 min后，用PBS冲洗3次，加山羊抗兔IgG二抗50 μL(FITC标记，稀释比例为1∶100)，37 ℃孵育30 min，避光操作，PBS冲洗3次；50%甘油PBS溶液封片。阴性对照用PBS代替一抗。激光共聚焦观察：用激光共聚焦显微镜扫描FITC标记的阳性反应物。选物镜为60倍，Zoom为1.0，激发光波长为488 nm，观测光为(515±30)nm。应用Lasersharp 2000软件(4.5.3)摄像、分析，观察海马视野的荧光密度，计算平均值。
2.5 统计学处理
应用 SPSS 19.0统计软件包，实验数据以x± s 表示。方差齐时选用LSD检验；方差不齐时选用Dunnett T3检验。使用双侧检验法，P＜0.05时认为差异具有统计学意义。
3 结果
Bcl-2、caspase-3蛋白在正常对照组大鼠海马组织中只见极少量表达，在SAH组和NS+SAH组大鼠海马组织中表达明显增多，且与正常对照组比较，荧光强度值有显著性差异(P＜0.01)，SAH组与NS+SAH组比较无统计学差异；CGRP+SAH组与SAH组、NS+SAH组相比，Bcl-2蛋白表达明显增多，caspase-3蛋白表达明显降低，且各组荧光强度值差异有统计学具意义(P＜0.01)。结果见表1 和图 1～2。
表1 各组大鼠海马细胞 Bcl-2及 caspase-3的蛋白表达(n=12,x± s )
Tab. 1 Expression of Bcl-2 and caspase-3 protein in hippocampus of rats in each group(n=12,x± s )
注：与正常对照组比较，1)P＜0.01；与SAH组比较，2)P＜0.01；与NS+SAH组比较，3)P＜0.01。
Note: Compared with control group, 1)P＜0.01; compared with SAH group,2)P＜0.01; compared with NS+SAH group, 3)P＜0.01.
图1 各组大鼠Bcl-2蛋白表达的检测结果(600×)
Fig. 1 Detection of Bcl-2 protein expression in rats of each group(600×)
图2 各组大鼠caspase-3蛋白表达的检测结果(600×)
Fig. 2 Detection of caspase-3 protein expression in rats of each group(600×)
4 讨论
在CVS的发生和发展中，缩血管物质和扩血管物质的比例失衡是关键，内皮素(ET)等缩血管因子的大量释放，消耗了大量内源性 CGRP来舒张血管，从而维持脑组织必需的血流量[10-11]。研究发现[5]，SAH后内源性CGRP的消耗及活性下降与CVS以及继发性脑缺血损伤的发生是密不可分的。实验证明，CGRP的生物活性被阻断可使CVS程度加重，外源性CGRP可使脑血管反应性增强，这提示补充外源性 CGRP可有益于 SAH后 CVS及继发缺血损伤的防治[12]。CGRP能有效改善脑血流量，主要机制为调节细胞内 Ca2+的浓度、拮抗内皮素、扩张脑血管及减轻缺血损伤等[13-15]。SAH后内源性CGRP的损耗在CVS的发生、发展中担任非常重要的角色，但外源性 CGRP分子量大、不易透过血脑屏障，限制了其常规给药途径[7-8]。近年来，针对如何使大分子肽类和蛋白质药物透过血脑屏障进入中枢，已进行了大量的实验研究。研究证明鼻-脑直接转运途径的存在，经鼻能使大分子药物有效地导入中枢[16]。因此本实验采取经鼻靶向给药这一新给药途径，避开血脑屏障的阻碍，研究结果证实经鼻靶向给药CGRP是可行的，可有效抑制海马细胞的凋亡。
本研究发现Bcl-2、caspase-3蛋白在正常对照组大鼠海马组织中仅见极少量表达；在SAH组和NS+SAH组中发现均明显增多；CGRP组Bcl-2蛋白表达比其他组增多，caspase-3蛋白表达比SAH组和NS+SAH组减少。细胞凋亡是多基因严格控制的过程，具有复杂的细胞分子调控机制，这些基因在种属之间非常保守，其中包括Bcl-2家族、caspase家族、抑癌基因p53等，研究表明多种基因在脑损伤和血管痉挛中参与凋亡的发生[17]。本研究发现，经鼻给予CGRP治疗后，Bcl-2蛋白表达增多，caspase-3蛋白表达下降，从而起到对脑缺血损伤的保护作用。
综上所述，在SAH后CVS及继发性脑缺血损伤的发生、发展过程中，细胞凋亡是其关键因素之一。本实验发现经鼻靶向给药能绕过血脑屏障，有效抑制细胞凋亡，从而对SAH后脑缺血损伤起到保护作用。
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