宫颈鳞癌是妇科常见的三大肿瘤之一，其发病率仅次于乳腺癌，严重威胁广大女性的生命健康[1-3]。人乳头瘤病毒(human papulloma virus，HPV)是一种 DNA病毒，可造成皮肤黏膜鳞状上皮细胞增殖，在宫颈鳞癌的发生、发展中发挥着重要作用，尤其是高危型(high risk，HR)HPV感染是宫颈鳞癌及癌前病变的主要病因[4]，早期清除HPV感染，对防治宫颈鳞癌意义重大[5]。重组干扰素是常见广谱抗病毒药物，可抑制细胞增殖，增强巨噬细胞的吞噬作用，提高淋巴细胞对病毒及靶细胞的细胞毒性，有效增强天然杀伤性细胞功能，提高免疫功能，抑制病毒感染，具有较高的临床应用价值。本研究探讨重组干扰素治疗后，患者HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白和血管生长因子(VEGF_C)表达水平变化，及其对宫颈鳞癌的预测价值。
1 资料与方法
1.1 一般临床资料
选取2013年2月—2017年2月长兴妇幼保健院收治的慢性宫颈炎患者35例、宫颈鳞癌前病变患者25例和宫颈鳞癌患者30例，分别作为慢性宫颈炎组、癌前病变组和宫颈鳞癌组。本研究经医学伦理委员会批准，患者及其家属均自愿参与，并签署知情同意书。
1.2 纳入及排除标准
所有患者均符合年龄＞18岁，有性生活史；月经周期规律；经阴道镜及宫颈液细胞学检测确诊；HPV阳性；患者知情并自愿参与。排除妊娠、哺乳期妇女；排除合并生殖道炎症、严重脏器疾病、过敏体质、精神病及入组前参与其他临床试验患者。
1.3 治疗方法
月经结束后第 3天开始用药，每晚睡前将重组人干扰素α2β栓(100 000 IU)(安徽安科生物工程集团股份有限公司，批号：20130104)送入阴道深处穹窿处，每天1次，使用9次为1个疗程，待下次经期结束后3 d可进行下个疗程，所有受试者均接受3个疗程治疗。治疗过程中禁止性生活。
1.4 HR HPV DNA负荷量检测
患者经期结束后3 d，无需进行阴道冲洗，用宫颈刷在宫颈口逆时针旋转3圈并停留10 s，然后将其放置于细胞保存液中，进行HR HPV DNA负荷量检测。采用美国Digene公司第2代杂交捕获试验试剂盒(hybird capture II，HC-II)检测HR HPV DNA负荷量，严格按照说明书规范操作。衡量标准：采用受检标本检测值相对发光单位(relative luminous unit，RLU)与阴性测定值(cut off，CO)的比值(RLU/CO)表示。RLU/CO＞1为阳性，反之为阴性，RLU/CO值越高，表示病毒含量越高，按照其比值大小分为 4个等级：1～100、101～500、501～1 000、＞1 000。
1.5 组织HPV16-E7蛋白和VEGF_C
采用 10%多聚甲醛固定标本，脱水、石蜡包埋，做成4 μm厚切片，抗原热修复，严格根据说明书SP法免疫组化染色。用PBS代替一抗作为阴性对照。HPV16-E7蛋白阳性：细胞质、核呈棕黄色，连续 10个高倍视野观察阳性细胞数＞10%。VEGF_C阳性：细胞质中有棕黄色，高倍镜下选取10个视野，分别计数100个细胞，其中阳性细胞数≥76%为+++，51%～75%为++，26%～50%为+[6]。
1.6 统计学处理
采用SPSS 19.0进行统计分析，首先对资料进行正态性检验以及方差齐性检验，符合正态分布的数据资料中计量资料采用x± s 表示，组间比较使用t检验，以P＜0.05为有统计学意义；技术资料使用例数和组成比例表示，组间比较使用χ2检验，以P＜0.05为有统计学意义。然后进行回归分析，筛选有价值的肿瘤标志物，以各个体预测概率的新变量为检验变量，诊断结果为状态变量，做ROC曲线分析，计算曲线下面积(AUC)。
2 结果
2.1 患者一般资料分布
本次研究中患者年龄 23～60岁，平均年龄(38.5±5.5)岁；其中慢性宫颈炎组患者24～58岁，平均年龄(37.8±5.8)岁；癌前病变组患者 27～60岁，平均年龄(39.1±5.4)岁；宫颈鳞癌组患者24～60岁，平均年龄(38.2±5.3)岁；3组患者基本情况分布特征差别未见统计学意义，具有可比性。
2.2 治疗前后HR HPV DNA负荷量比较
治疗前，3组HR HPV DNA负荷量两两相比差异有统计学意义(P＜0.05)，HR HPV DNA负荷量随着宫颈病变程度严重而逐渐增多；治疗后，宫颈鳞癌组的HR HPV DNA负荷量显著高于癌前病变组(P＜0.05)，癌前病变组显著高于慢性宫颈炎组(P＜0.05)。见表 1。
表1 治疗前后HR HPV DNA负荷量
Tab. 1 The value of HR HPV DNA load for pre-treatment and post-treatment
注：与慢性宫颈炎组比较，1)P＜0.05；与癌前病变组比较，2)P＜0.05。Note: Compared with chronic cervicitis group, 1)P＜0.05; compared with cervical precancerous lesions group, 2)P＜0.05.
2.3 治疗前后HPV16-E7蛋白和VEGF_C表达水平比较
与治疗前比较，各组的 HPV16-E7蛋白和VEGF_C表达水平未显著降低。治疗前后，二者表达水平情况，宫颈鳞癌前病变组显著高于慢性宫颈炎组(P＜0.05)，宫颈鳞癌组显著高于宫颈鳞癌前病变组(P＜0.05)，结果见表2。
表2 治疗前后HPV16-E7蛋白和VEGF_C表达水平对比
Tab. 2 Comparison of the expression level of HPV16-E7 protein and VEGF_C for pre-treatment and post-treatment
注：与慢性宫颈炎组比较，1)P＜0.05；与癌前病变组比较，2)P＜0.05。
Note: Compared with chronic cervicitis group, 1)P＜0.05; compared with cervical precancerous lesions group, 2)P＜0.05.
2.4 各组HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白、VEGF_C的多元逐步Logistic回归
以HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白和VEGF_C检测结果为自变量，宫颈病变结果作为因变量(慢性宫颈炎为0，宫颈鳞癌前病变为1，宫颈鳞癌为2)，采用多元逐步logistic回归分析，结果显示，宫颈鳞癌=-2.763+0.275 HR HPV DNA负荷量+1.581 HPV16-E7蛋白+1.216 VEGF_C(χ2=36.781，P＜0.001)，经 Hosmer-leme-show 检验显示观测数据与预测数据无显著性差异。
2.5 HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白和VEGF_C水平ROC曲线
ROC曲线分析结果显示，HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白、VEGF_C 3项联合应用对于宫颈鳞癌的预测概率的AUC最大，为 0.91，结果见表3和图1。
表3 HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白、VEGF_C单项检测及3项联合检测对宫颈鳞癌检测的ROC曲线分析
Tab. 3 ROC curve for different examination types for HR HPV DNA load, HPV16-E7 protein and VEGF_C
图1 HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白、VEGF_C单项检测及3项联合预测的ROC曲线
Fig. 1 ROC curve for different examination types for HR HPV DNA load, HPV16-E7 protein and VEGF_C
3 讨论
宫颈鳞癌是一个长期连续发作的慢性过程，从正常的宫颈，发展为宫颈上皮内瘤样病变，而后再发展为浸润癌[2]。因此，宫颈鳞癌防治的关键是早期发现、早期处理癌前病变。HR HPV感染是造成宫颈鳞癌的主要原因，目前研究发现HPV的致病机制是其中的E6、E7癌蛋白可以结合宿主细胞的p53、pRB蛋白，导致其降解、失活，进而引起上皮细胞持续增生发生癌变[6-7]。Tang等[8]研究发现转化细胞中E7蛋白持续表达以维持转化恶性表型。Zhou等[9]研究发现 HPV-E6蛋白可促使上皮细胞过表达COX-2及VEGF_C，从而促使宫颈鳞癌浸润、转移。
VEGF_C作为近年来被发现和淋巴转移关系密切的生长因子，主要由卵巢、淋巴结等器官组织表达[10-11]。其发生作用的受体主要包括VEGFR-2和VEGFR-3，其中VEGFR-2可提高血管通透性、促进血管增生；而VEGFR-3可调节淋巴管生成。VEGF_C结合VEGFR-2受体后可刺激血管内皮细胞增殖，增加血管通透性，而没有基底膜和紧密连接的淋巴管内皮细胞有助于癌细胞进入淋巴管，淋巴管越多，癌细胞进入机率越大，然后癌细胞通过内皮细胞壁黏附作用靠近管腔内壁移向阻力低的地方，浸润蔓延，导致淋巴管腔阻塞、淋巴引流受阻，形成新的侧枝循环，癌细胞借此扩散，进一步导致肿瘤细胞浸润、转移[12]。VEGF_C结合VEGFR-2受体，通过PI3K途径激活抗调亡蛋白表达，从而抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤生长。VEGF_C结合VEGFR-3后可磷酸化VEGFR-3受体，激活下游多信号通路，促使淋巴管内皮细胞增殖、分化、迁移、抗凋亡等。宫颈鳞癌初期，VEGF_C可结合VEGFR-3受体来激活p44/p42 MAPK通路，转录、翻译相关生长基因，促进细胞增殖、引起肿瘤发生[13-15]。
研究表明，HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白和VEGF_C在宫颈鳞癌的诊断及预后评价中具有重要意义，且治疗因素也会对预后发生重大影响，故本研究在重组人干扰素α2β治疗因素存在的背景下进行相关分析。本研究结果显示，治疗前，3组HR HPV DNA负荷量随着宫颈病变程度加深而逐渐增多；治疗后宫颈鳞癌组的 HR HPV DNA负荷量显著高于癌前病变组，癌前病变组显著高于宫颈鳞癌组。HPV16-E7蛋白和 VEGF_C表达水平虽然并未显著降低，但是宫颈鳞癌前病变组显著高于慢性宫颈炎组，宫颈鳞癌组显著高于宫颈鳞癌前病变组。本研究对影响治疗的因素进行多元归分析，结果显示，HR HPV DNA负荷量、HPV16-E7蛋白和 VEGF_C联合用于宫颈鳞癌的预测的 AUC最大(0.91)。该结果表明，重组人干扰素α2β治疗后，可以通过HR HPV DNA负荷量联合HPV16-E7蛋白和VEGF_C蛋白用于宫颈鳞癌的预测，预测价值较好。
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