美托洛尔是 β受体阻滞剂，用于治疗心血管疾病，因其安全、高效，目前已成为国内外临床常用的药物之一[1-2]。美托洛尔口服吸收迅速、完全，血浆蛋白结合率较低，约为 12%，在肝脏经多条途径代谢，主要以代谢物的形式经肾排泄。口服美托洛尔存在较大个体差异，临床治疗的血药浓度可相差20倍，而其体内血药浓度与其药理作用存在相关性，因此对其血药浓度的监测能较好地使药物得到合理应用，并达到较好的治疗效果[3-7]。目前，检测人血浆中美托洛尔血药浓度的方法主要为HPLC，一方面采用荧光检测器检测，血浆样品通常需要碱化，步骤复杂，容易影响回收率，在低浓度生物样本中应用有限，特别是药物末端消除中血药浓度[8-9]；另一方面HPLC为生物样本检测已作出相当贡献，然而较UHPLC分析时间长[10]，无法更好地满足临床高通量检测要求。故建立灵敏、高效、精准和高通量美托洛尔血药浓度的分析方法有重要意义。本实验建立UHPLC-MS/MS，为人血浆中美托洛尔血药浓度监测和药动学试验提供灵敏可靠的测定方法。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Agilent 1290 UHPLC二元液相色谱系统(美国Agilent公司)，包括在线脱气机，G7120A二元泵，G7167B自动进样器和 G7116B柱温箱；Agilent 6470 Triple Quad质谱仪，配有标准AJS ESI电喷雾离子源，G3335AA MassHunter Qualitative Analysis Software分析工作站(美国Agilent公司)；METTLER AE240型十万分之一电子天平(美国赛默飞世尔科技公司)； Micro 17低温离心机(德国艾本德股份公司)；Millipore超纯水仪(美国密理博公司)。
1.2 试药
美托洛尔对照品(批号：100084-201403)和内标物卡马西平(批号：0142-9503)均购自中国药品生物制品检定研究院，纯度均＞98%；甲酸(色谱纯，美国恩科化学)；甲醇和乙腈(色谱纯，美国霍尼韦尔)；水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 分析条件
2.1.1 色谱条件 Agilent RRHD PLUS C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，柱温：30 ℃。流动相系统采用 0.2%甲酸水溶液-乙腈(68∶32)。流速：0.3 mL·min-1。分析时间：3.5 min。进样量：2 μL。
2.1.2 质谱条件 采用AJS ESI正离子模式，ESI源参数设置：干燥气温度为 350 ℃；干燥气流速为10 L·min-1；雾化器压力为40 psi；鞘气温度为350 ℃；鞘气流速为 11 L·min-1；毛细管电压为4 000 V；喷嘴电压为2 000 V。多反应监测的参数设置：美托洛尔m/z 268→116，碎片电压为120 V，碰撞能量为20 eV；卡马西平(inter standard，IS) m/z 237→194，碎片电压为120 V，碰撞能量为35 eV。美托洛尔保留时间为0.8 min，卡马西平保留时间为2.0 min。
2.2 对照品溶液的配置
2.2.1 美托洛尔对照品溶液的配制 精密称取美托洛尔对照品10.12 mg，置于5 mL量瓶中，加水溶解定容，配成2.024 mg·mL-1的对照品储备液；取上述对照品储备液适量，置于10 mL量瓶，用乙腈按一定比例逐级稀释，配成浓度分别为20.24，40.48，80.96，202.4，1 012，4 048，10 120，15 148 ng·mL-1的系列对照品溶液，置 4 ℃冰箱保存。
2.2.2 质控样品溶液的配制 精密称取美托洛尔对照品10.15 mg，置于10 mL量瓶中，加水溶解定容，配成1.015 mg·mL-1的质控样品储备液；取质控样本储备液，置于10 mL量瓶，用乙腈按一定比例逐级稀释，配制成浓度分别为20.30，40.60，1 015，10 150 ng·mL-1的质控样品溶液；取空白血浆950 μL，精密加入上述质控样品溶液50 μL，旋涡混匀，配成浓度分别为1.015 ng·mL-1(定量限)，2.030 ng·mL-1(QC-L)， 50.75 ng·mL-1(QC-M)，507.5 ng·mL-1(QC-H)的质控样品溶液，待用。
2.2.3 卡马西平内标溶液的配制 精密称取卡马西平对照品5.10 mg，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，配成1.020 mg·mL-1的内标储备液；取上述储备液适量，置于5 mL量瓶，用乙腈稀释10倍，得102.0 ng·mL-1的内标溶液，置于4 ℃冰箱保存，备用。
2.3 血浆样品处理方法
从冰箱中取出血浆样品置于室温下解冻，取50 μL 血浆，依次加入 50 μL 内标溶液，150 μL 乙腈，涡旋30 s，于4 ℃下10 000 r·min-1高速离心10 min，取上层清液100 μL于进样小瓶中，进行UHPLC-MS/MS分析。
2.4 血浆样品分析方法验证
2.4.1 方法特异性 取空白血浆 50 μL，按“2.3”项下方法操作，进样2 μL，获得空白样品的色谱图1A；取质控样品溶液1.015 ng·mL-1，加入内标溶液102.0 ng·mL-1，依同法进行样品处理，获得相应的色谱图1B。取受试者给药后收集的血浆样品，依同法进行样品处理，获得相应的色谱图1C。结果表明，空白血浆中的内源性物质与被分析物达到基线分离，不影响测定。
2.4.2 标准曲线与线性范围 取空白血浆950 μL，精密加入系列美托洛尔对照品溶液50 μL，旋涡混匀，配成浓度分别为1.012，2.024，4.048，10.12，50.60，202.4，506.0，759.0 ng·mL-1的标准含药血浆，取此工作曲线样本50 μL，按“2.3”项下方法操作，进样分析，记录色谱图，计算美托洛尔峰面积与内标峰面积的比值。以血浆中待测物浓度(X)为横坐标，待测物与内标的峰面积比值(Y)为纵坐标，权重系数1/X，进行线性回归计算，求得回归方程：Y=0.012 8X+0.009 5(r=0.999 2)，实验表明美托洛尔在血浆中浓度 1.012～759.0 ng·mL-1内呈良好线性关系。
2.4.3 定量限与检测限 经逐级稀释，以S/N≥10，测得美托洛尔在血浆中的定量限为1.012 ng·mL-1；以 S/N≥3，测得美托洛尔在血浆中的检测限为0.253 ng·mL-1。
2.4.4 准确度和精密度 制备含美托洛尔浓度分别为 1.015，2.030，50.75，507.5 ng·mL-1的含药血浆，每个浓度平行操作5份，按“2.3”项下方法操作，进样分析。并于每天配制低、中、高浓度血浆样本各5份，按“2.3”项下方法操作，进样分析，连续3 d。将美托洛尔和内标峰面积的比值代入当天的随行标准曲线求得实测浓度，计算准确度及批内、批间精密度，结果见表1～2。
图1 血浆中美托洛尔和内标的典型色谱图
1-美托洛尔；2-卡马西平(IS)；A-空白血浆；B-空白血浆加入对照品(1.015 ng·mL-1)及内标(102.0 ng·mL-1)；C-受试者给药后血浆。
Fig. 1 Representative MRM chromatograms of metoprolol and IS in human plasma
1-metoprolol; 2-carbamazepine(IS); A-blank plasma; B-blank plasma spiked with metoprolol(1.015 ng·mL-1) and IS(102.0 ng·mL-1);C-subject plasma spiked with IS.
表1 美托洛尔批内准确度及精密度试验结果(n=5)
Tab. 1 Results of within-run accuracy and precision experiments of metoprolol(n=5)
表2 美托洛尔批间准确度及精密度试验结果(n=5)
Tab. 2 Results of between-run accuracy and precision experiments of metoprolol(n=5)
2.4.5 基质效应 分别取 6个不同健康志愿者的空白血浆，按“2.3”项下方法操作，取上清液后加入美托洛尔质控及内标溶液，以使其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致；同时配制含有一定量待测物和内标的乙腈溶液，其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致，按“2.1”项下LC-MS方法进样分析得峰面积。对于每个来源空白基质，计算基质存在下的峰面积与不含基质的峰面积比值，得到待测物和内标的基质因子。进一步通过待测物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子，低、中、高浓度的基质效应的变异系数＜5%，结果见表3。
表3 美托洛尔基质效应试验结果(n=6)
Tab. 3 Results of matrix effect of metoprolol(n=6)
2.4.6 提取回收率 制备美托洛尔低、中、高浓度分别为 2.030，50.75，507.5 ng·mL-1的含药血浆样本，按“2.3”项下操作，取上清液后加入美托洛尔对照品溶液及内标溶液，其最终浓度分别与低、中、高浓度质控样品的进样浓度一致，进样分析得峰面积，每个浓度平行操作 6份，结果见表4。
表4 美托洛尔提取回收率试验结果(n=6)
Tab. 4 Results of extraction recovery experiments of metoprolol(n=6)
2.4.7 稳定性考察 制备含有美托洛尔浓度分别为 2.030，50.75，507.5 ng·mL-1血浆样品，分别考察室温放置4 h后处理、置自动进样器4 ℃下放置24 h冻融循环3次，以及-80 ℃下放置1个月后的稳定性，每个浓度平行操作3份。按“2.3”项下方法操作，进样分析，记录色谱峰面积，计算待测物峰面积和内标峰面积的比值，代入随行标准曲线计算样品的浓度，并计算测得值与理论值的相对偏差(RE)，结果见表5。
2.4.8 残留效应 取工作曲线最高点(759.0 ng·mL-1)样本，按“2.1”项下条件连续进样5次，之后进样空白血浆处理样本，记录色谱峰，分析物保留时间处干扰峰响应均低于定量下限中分析物响应的 20%，内标保留时间处的干扰峰的响应均低于零浓度样品中内标响应的 5%。结果表明，残留可忽略，不影响定量分析。
3 讨论
3.1 检测器选择
本试验选择了一种高灵敏度、极强定性特性的检测器。原理是化合物经过离子化后进行检测，对没有紫外吸收的物质具有明显的优势，无须相关衍生化前处理，同时由于蒸发了溶剂，没有溶剂的干扰，得到的基线平稳，并与血浆中内原性杂质峰分离完全，不干扰样品峰的测定，基线噪音小和检测限低，特别适用于血药浓度低的体内分析实验。而美托洛尔的体内末端消除时药物浓度低，需要高灵敏度检测器，最终选择MS检测器。
3.2 流动相的优化
流动相有机溶剂选择洗脱能力相对较强的乙腈，血浆中内源性杂峰分离完全，不干扰样品峰的测定，基线噪音小。考察流动相的有机添加剂，发现酸性条件(甲酸、乙酸)和缓冲盐(乙酸铵、三乙胺)有助于改善美托洛尔峰形，但缓冲盐严重抑制质谱信号。试验表明，在0.2%甲酸水溶液中，检测灵敏度均能达到令人满意的结果，且结果稳定可靠。
3.3 质谱条件的优化
采集了 AJS ESI离子源正负离子模式下的质谱信息。经过对比发现，负离子模式下化合物的响应值远远不及正离子模式下的响应值，因此确定使用正离子模式进行信号采集。依据质谱参数对仪器灵敏度的影响大小排序依次为鞘气温度及流速、喷嘴电压、雾化气压力、毛细管电压、干燥气温度及流速，笔者依次尝试调节优化，根据各项参数对于质谱信号强弱的影响，最终确定质谱参数分别为鞘气温度 300 ℃，鞘气流速12 L·min-1，喷嘴电压 2 000 V，雾化器压力 45 psi，毛细管电压4 000 V，干燥气温度200 ℃，干燥气流速 5 L·min-1。
3.4 样品前处理的优化：
分别考察甲醇和乙腈沉淀蛋白，结果发现甲醇沉淀样品周围有小的干扰，乙腈沉淀完全，基质效应更低，同时考虑与流动相有更好的相容性，选择乙腈作为沉淀剂。进一步考察乙腈与血浆以2∶1，3∶1和4∶1的比例来沉淀蛋白，发现乙腈以3∶1和4∶1比例，提取回收率高，峰型更好，最终选定乙腈与血浆比例为3∶1。
3.5 色谱柱的优化
在实验过程中，共考察了 3根色谱柱：分别是CAPCELL PAK C18 MG (3.0 mm×100 mm，3.0 μm)、 Agilent Proshell EC C18(3.0 mm×100 mm，2.7 μm)、 Waters XBridge C18(3.0 mm×100 mm，3.5 μm)，三者柱效各有高低，但均可以得到良好的重复性，同时其他色谱峰在 3根色谱柱中也可以得到良好的分离效果。但运行时间都比 Agilent RRHD PLUS C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)要长。因此，本研究选用高效快速的色谱柱 Agilent RRHD PLUS C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，能满足临床大量血浆样本美托洛尔血药浓度监测的需要。
表5 美托洛尔的放置稳定性试验结果(n=3)
Tab. 5 Results of placement stability experiments of metoprolol(n=3)
3.6 基质效应
方法学验证试验证明，血浆中内源性物质不干扰测定。以血浆为基质进行基质效应考察时，美托洛尔低、中、高 3个浓度的基质效应分别为105.9%，106.1%，106.9%，信号强度稳定，符合方法学验证要求。因此，在美托洛尔的药动学研究中，可采取受试者血清样本进行分析。
与国内外已报道的测定美托洛尔血药浓度的方法相比[8-9]，本实验建立的UHPLC-MS/MS法，样品采用沉淀蛋白法处理，操作简便，回收率较高，定量限为 1.015 ng·mL-1，每个样本的分析周期仅3.5 min。因此，本研究建立的 UHPLC-MS/MS法具有灵敏度高，方法简便快捷、专属性好等特点，可用于血清中美托洛尔浓度的测定。特别适合其药动学中末端消除相中低浓度的检测，为评价美托洛尔生物利用度提供一种精准可靠的分析方法。
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