复方感冒灵片是常用的抗感冒非处方药，具有辛凉解表、清热解毒的作用，常用于风热感冒及温病之发热、咽喉红肿疼痛、咳嗽等表证[1]。复方感冒灵片主要由金银花、五指柑、野菊花等 6味中药材和对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那 3种化学成分组成。其中，对乙酰氨基酚通过抑制中枢前列腺素的合成，发挥解热镇痛作用；马来酸氯苯那敏为抗组胺类药物，主要用于鼻炎、皮肤黏膜过敏及打喷嚏、流涕等感冒症状，但用药后常见精神抑制导致困倦的不良反应；咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，属于中枢神经兴奋剂，常用来对抗感冒药中马来酸氯苯那敏导致的困乏嗜睡这一不良反应。复方感冒灵片为《中药成方制剂》(第十二分册)收载的品种，国内外药典均未收载。现行标准尚未对复方感冒灵片设置溶出度检查项目，且目前国内少见对复方感冒灵片溶出度测定方法的研究报道[2-7]。药物溶出度与原料药、辅料的质量优劣、生产工艺等因素密切相关，其差异是临床疗效不一的原因之一[8]。对于口服固体制剂，溶出度作为一种控制药品质量的重要指标，已广泛应用于药品的研发、生产和监督检验中，溶出度试验结果更是评价口服固体制剂质量的一个重要指标。为了更好地控制复方感冒灵片的内在质量，更加全面地评价其生产工艺，完善其药品标准，保障用药安全，笔者参考中国药典2015年版(四部)溶出度与释放度测定法(篮法)[9]和2015年版《普通口服固体制剂溶出度试验技术指导原则》[10]中的要求，对复方感冒灵片进行了溶出度考察，采用 HPLC测定复方感冒灵片中对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏溶出度，进而采用2条溶出曲线相似性参数评价方法(相似因子法)[11]考察了3家国内生产企业的3批复方感冒灵片的溶出曲线相似性，从而为评价该制剂的内在质量提供有效方法，也为生产企业优化生产工艺提供参考。
1 材料
1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司，G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1329A自动进样器，G1316A柱温箱，G1314B紫外检测器)；RCZ-8MD溶出试验仪配备 RZQ-8D取样收集器(天津天大天发公司)；XS205电子天平、pH计(北京梅特勒-托利多)；Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 µm)色谱柱。
1.2 药品与试剂
对乙酰氨基酚对照品(批号：100018-201409，含量为 99.5%)、咖啡因对照品(批号：17015-201211，含量为 99.9%)和来酸氯苯那敏(批号：100047-201507，含量为99.8%)均购自中国食品药品检定所；乙腈为色谱纯(TEDIA)；水为超纯水；盐酸、磷酸和三乙胺为市售分析纯。
3批复方感冒灵片为不同厂家的市售品，3个批号分别为厂家A，批号：17030120；厂家B，批号：17030130；厂家C：17030140。
2 方法与结果
2.1 对照品储备液的制备
分别精密称取咖啡因0.012 87 g、马来酸氯苯那敏0.013 07 g于100 mL量瓶中，加0.1 mol·L-1盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密移取5 mL至20 mL量瓶中，用0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，分别得32.175 μg·mL-1的咖啡因贮备液、32.675 μg·mL-1的马来酸氯苯那敏贮备液；精密称取对乙酰氨基酚0.01 g于20 mL量瓶中，0.1 mol·L-1盐酸溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，得506.5 μg·mL-1对乙酰氨基酚贮备液。取上述咖啡因、马来酸氯苯那敏对照品贮备液各5 mL，对乙酰氨基酚贮备液2 mL加至20 mL量瓶中，用0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，得混合对照品贮备液。另取咖啡因、马来酸氯苯那敏对照品贮备液各 5 mL，加至 20 mL量瓶中，用0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，得咖啡因和马来酸氯苯那敏混合对照品贮备液。
2.2 供试品溶液的制备
取样品1片，按照溶出度与稀释度测定法(中国药典 2015年版通则 0931第一法篮法)，以1 000 mL 的0.1 mol·L-1盐酸为溶出介质，转速为100 r·min-1，温度控制在(37±0.5)℃，依法操作。30 min后，取溶液5 mL，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3 阴性样品溶液的制备
依据复方感冒灵片处方的制备方法，制备不含对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏的阴性样品。按“2.2”项下方法操作，制备阴性样品溶液。
2.4 色谱条件与系统适用性试验
色谱柱：Kromasil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(含0.5%磷酸、0.4%三乙胺)=10∶90；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：对乙酰氨基酚为244 nm，咖啡因和马来酸氯苯那敏为264 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。分别精密吸取咖啡因和马来酸氯苯那敏混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液20 μL测定，结果各成分达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以对乙酰氨基酚计≥2 000。结果表明，其他成分对测定无干扰。色谱图见图1。
2.5 滤膜吸附试验
取“2.1”项下对照品溶液制备过程中所得混合对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件直接进样测定；又经一次性针式过滤器(水系，0.45 μm)滤过，弃去3 mL初滤液，按“2.4”项下色谱条件进样测定。结果显示，滤过前后对照品溶液对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏峰面积无明显变化，说明一次性针式过滤器(水系，0.45 μm)对对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏无吸附。
2.6 线性范围
分别精密量取对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏的对照品贮备液1.0，2.0，5.0，10.0，25.0 mL，分别置100 mL量瓶中，用0.1 mol·L-1盐酸溶液稀释至刻度。按“2.4”项下色谱条件，分别进样20 μL测定，以峰面积(A)为纵坐标，对照品浓度(C)为横坐标进行线性回归，对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏的线性方程分别为A=65.08C+163.6(r=0.999 9)，A=46.79C+0.316(r=1.000 0)，A=22.57C+0.437(r=1.000 0)；线性范围分别为 5.065～126.625，0.321 75～8.043 75，0.326 75～8.168 75 µg·mL-1。各组分线性良好，截距均不超过100%溶出时峰面积的2%，系统误差较小。
图1 高效液相色谱图
A-供试品；B-对照品(对乙酰氨基酚)；C-对照品(咖啡因+马来酸氯苯那敏)；D-阴性样品；1-对乙酰氨基酚；2-咖啡因；3-马来酸氯苯那敏。
Fig. 1 HPLC chromatograms
A-sample; B-standard solution(paracetamol); C-standard solution(caffein and chlorpheniramine maleate); D-blank control; 1-paracetamol;2-caffein; 3-chlorpheniramine maleate.
2.7 检测限与定量限的考察
分别将对照品贮备液用 0.1 mol·L-1盐酸溶液逐级倍稀，稀释至刻度，摇匀，按“2.4”项下色谱条件，分别进样20 μL测定，对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏在信噪比(S/N)值分别为10.2，10.1，10.6时，定量限分别为 0.019 5，0.125，0.511 µg·mL-1；在信噪比(S/N)值分别为 3.5，3.2，3.1 时检测限分别为 0.004 9，0.063，0.255 µg·mL-1。
2.8 重复性与中间精密度试验
取同一批样品(厂家A，批号：17030120)的细粉适量，按“2.2”项下方法制备6份相同的供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进样测定，计算供试品中 3种成分的溶出量，对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏的平均溶出度分别为99.6%，100.1%，100.3%，溶出量的 RSD分别为0.15%，1.01%，1.11%。取上述6份供试品溶液，由不同分析人员在不同日期、不同设备操作，计算对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏峰面积的RSD值分别为0.19%，0.95%，0.88%。
2.9 仪器精密度试验
分别精密吸取“2.1”项下对照品溶液适量，按“2.4”项下色谱条件连续测定6次。计算对乙酰氨基酚、咖啡因、马来酸氯苯那敏峰面积的RSD值分别为 0.17%，0.24%，0.65%，表明仪器精密度良好。
2.10 稳定性试验
取“2.2”项下供试品溶液(厂家 A，批号：17030120)适量，分别于 0，2，4，6，8，12，18，24 h按“2.4”项下色谱条件进样，计算对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏峰面积的RSD值分别为 0.37%，0.30%，1.66%，说明供试品溶液在24 h内稳定。
2.11 回收率试验
取同一批已知含量的复方感冒灵片(厂家 A，批号：17030120)9份，分别置于100 mL量瓶中，按制剂处方，分别精密加入低、中、高浓度的对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏，制成模拟处方样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.4”项下色谱条件测定，记录3种成分的峰面积，并计算加样回收率及其RSD，结果见表1。
2.12 溶出度测定结果
2.1 2.1 溶出度测试方法 采用中国药典 2015年版(四部)通则 0931第一法(篮法)。
2.1 2.2 样品溶出度测定结果 以经脱气的0.1 mol·L-1盐酸溶液 1 000 mL，转速 100 r·min-1，溶出温度(37±0.5)℃，每个溶出杯中加入1片样品进行实验，经30 min取液5 mL，所取溶出液经0.45 μm滤膜滤过，按“2.4”项下色谱条件，进样20 μL测定，记录色谱图。计算3个厂家的复方感冒灵片(批号：17030120、17030130、17030140)中对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏的溶出度，结果见表2。
表1 加样回收率试验(n=9)
Tab. 1 Results of recovery test (n=9)
表2 3批样品的溶出度测定结果(n=6)
Tab. 2 Dissolution results of 3 samples(n=6)
2.13 溶出曲线的考察
按“2.2”项下制备方法制备供试品溶液，采用 0.1 mol·L-1盐酸作为溶出介质，溶出体积为1 000 mL，转速为 100 r·min-1，温度控制在(37±0.5)℃，分别在 10，20，30，45，60 min 取样(并同时立即补充同样体积的溶出介质)，再按“2.4”项下色谱条件对3家生产企业3批样品进行测定。结果显示，对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏的溶出度均＞90%，3批样品的溶出度均达到了溶出度限度规定，但 3批样品中的马来酸氯苯那敏在溶出曲线上存在着差异，说明 3家企业的生产工艺存在着不同。溶出曲线见图2。
2.14 溶出曲线相似性评价
对国内3家生产企业的3批样品进行5个时间点的累积溶出度测试，以厂家A(批号为17030120)样品为参比制剂，采用FDA推荐使用的相似因子(f2)法[11]评价3批样品的溶出曲线的相似性。按以下公式计算f2值，结果见表3。
图2 不同生产企业样品中对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏的溶出度曲线
A-对乙酰氨基酚；B-咖啡因；C-马来酸氯苯那敏。
Fig. 2 Dissolution profiles of paracetamol, caffeine and chlorphenamine maleate of samples from different manufacturers
A-paracetamol; B-caffeine; C-chlorphenamine maleate.
表3 不同生产企业样品与参比制剂溶出曲线相似因子法分析结果
Tab. 3 Similarity factor method results of dissolution profiles of samples and reference prepareation from different manufacturers
式中：Rt为受试制剂在第t时间点的平均累积溶出度；Tt为参比制剂在第t时间点平均累积溶出度，n为溶出度试验的取样次数。评价标准：f2值的范围在 0～100内，f2的值越大说明2条曲线相似度越高。如果50≤ f2 ≤100，则表示2个样品的溶出度相似。
3 讨论
3.1 溶出条件的选择
3.1.1 溶出介质考察 取厂家A(批号为17030120)的样品1批，在转速为100 r·min-1、溶出介质体积为1 000 mL、温度控制为(37±0.5)℃条件下，本实验选择0.1 mol·L-1盐酸溶液，pH 4.0醋酸盐缓冲液、pH 6.8磷酸盐缓冲液和水作为考察的溶出介质，在采用 0.1 mol·L-1盐酸作为溶出介质时，样品的溶出度较佳，且 0.1 mol·L-1盐酸溶液的酸度跟人体胃液较为接近，因此本试验选择0.1 mol·L-1盐酸溶液为溶出介质。
3.1.2 转速的确定 取厂家 A(批号为 17030120)的样品1批，采用0.1 mol·L-1盐酸溶液为预试液，溶出介质1 000 mL，温度控制在(37±0.5)℃，考察了转速分别为 50，75，100，120 r·min-1时的溶出度。在4种不同转速下，3种成分累积溶出度无明显差异，为节约溶出时间，本试验转速采用100 r·min-1。
3.1.3 溶出介质体积的选择 取样品(生产厂家A，批号：17030120) 1批，溶出介质为0.1 mol·L-1盐酸，转速为 100 r·min-1，温度控制在(37±0.5)℃，考察了溶出介质体积为500，900，1 000 mL时样品的累积溶出度。在溶出体积采用1 000 mL时，咖啡因和马来酸氯苯那敏的溶出度没有明显差异，对乙酰氨基酚的溶出度稍大于采用900 mL作为溶出体积的溶出度；且采用1 000 mL作为溶出体积，对乙酰氨基酚的峰面积与浓度可以呈良好的线性关系，故本试验溶出介质体积选择1 000 mL。
3.1.4 取样时间的确定 本试验采用 0.1 mol·L-1盐酸作为溶出介质，溶出介质体积为1 000 mL，转速为100 r·min-1，温度控制在(37±0.5)℃，分别在10，20，30，45，60 min时取样，分别测定3个批号的复方感冒灵片中对乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏的溶出度。根据溶出曲线判断，30 min时，3批样品中的乙酰氨基酚、咖啡因和马来酸氯苯那敏的平均累积溶出度均＞85%，故拟定取样时间为30 min。
3.2 溶出曲线的评价
本试验通过绘制 3种主成分的溶出曲线，考察了3个生产企业中3批产品的内在质量区别，并使用相似因子法评价了其溶出曲线的相似性。从溶出曲线和相似因子法评价结果可以看出，不同生产企业的复方感冒灵片中对乙酰氨基酚和咖啡因的溶出曲线相似性较高；但在不同生产企业的产品之间，复方感冒灵片中马来酸氯苯那敏的累积溶出度存在着一定的差异，溶出曲线相似性较对乙酰氨基酚和咖啡因差，表明复方感冒灵片的生产在不同企业之间存在着生产工艺上的区别。在复方感冒灵片的现行质量标准中尚未设置溶出度检查项目，应尽快增加，完善该制剂的质量标准，以提高该药的用药安全性。
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