聚乙二醇 1000维生素 E琥珀酸酯(D-α-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate，TPGS)是一种水溶性维生素E，由维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)的游离羧基与聚乙二醇 1000(polyethylene glycol 1000，PEG 1000)一端的羟基酯化而成。由于两端同时具有疏水及亲水基团，TPGS是一种良好的非离子型表面活性剂，已作为药用辅料收载于美国药典，近年来在药物制剂中广泛应用，可用作增溶剂[1-2]、乳化剂[3]、吸收促进剂[4]、增塑剂[5]、药物载体(如脂质体、混合胶束、纳米粒)[6-8]等。
TPGS中除主要成分 TPGS单酯(TPGS monoester，TME)外，还存在 TPGS双酯(TPGS diester，TDE)，以及游离的 α-生育酚(α-tocopheryl，TCP)、VES、PEG1000等。TDE是由于PEG 1000两端的羟基均被VES酯化，使两端均存在疏水基团，导致其表面活性作用较TME明显降低，且理化性质差异较大，因此TPGS中TDE、VES、TCP、PEG 1000的含量是控制TPGS质量的重要指标。对照品外标法是测定已知组分含量的最佳方法，但未见有TME及TDE的对照品出售。目前制备液相色谱法作为一种直观快速的分离制备手段，已在复杂组分的分离纯化中被大量应用[9-13]。本实验拟采用制备液相色谱分离制备TPGS中的TME、TDE，并建立 HPLC及 HPLC-ELSD的方法检测TPGS中的TME、VES、TCP、TDE及PEG 1000含量。TME、TDE结构见图1。
图1 TME和TDE的结构式
A-TME；B-TDE。
Fig. 1 Structure of TME and TDE
A-TME; B-TDE.
1 仪器与试剂
Agilent SD-1制备型液相色谱仪、Agilent 1200液相色谱仪、Agilent 1100液相色谱仪(配有Alltech 2000ES ELSD检测器)均购自美国Agilent公司；UPLC-Q-TOF液质联用仪(Waters公司)；AVANCE-400核磁共振仪(Bruker公司)；Heidolph Laborota 4001 旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)；XA205 型电子分析天平(瑞士梅特勒公司)。
TPGS(瑞源生物科技有限公司，批号20111103，20111104，20111105)；VES 对照品(阿拉丁试剂，批号：F1510019；纯度：99.6%)，TCP对照品(美国Supelco公司，批号：LB85173V；纯度：99.2%)；PEG 1000对照品(分析纯，光复精细化工研究所，批号：20120413；纯度：99.0%)；乙腈、异丙醇、乙醇(色谱纯，美国Merck公司)；甲酸(分析纯，天津市康科德科技有限公司)；水为超纯水。
2 方法与结果
2.1 TME与TDE的制备
2.1.1 制备液相色谱条件 色谱柱：DAC-HB50 C18动态轴向压缩色谱柱(50 mm×250 mm，10 μm)；流动相：纯化水为流动相A，乙醇为流动相 B；梯度洗脱(0～10 min，60%→95%B；10～15 min，95%B；15～20 min，95%→100%B；20～40 min，100%B；40～41 min，100%→60%B；41～55 min，60%B)；流速：75 mL·min-1；柱温：室温；检测波长：285 nm；进样量：5 mL。
2.1.2 供试品溶液的制备 取TPGS适量，用乙醇溶解并稀释制成约 100 mg·mL-1的溶液，摇匀即得。
2.1.3 TME和TDE的制备 精密量取制备供试品溶液5 mL注入Agilent SD-1制备型液相色谱仪，按“2.1.1”项下条件进行梯度洗脱，收集相应色谱峰处馏分，然后在40～46 ℃下旋转蒸发去除溶剂，即得。
2.2 制备获得对照品的结构确证
2.2.1 质谱 TME对照品：ESI-MS m/z 772.474 4[M+2H]+信号最强，相邻信号质荷比差值为 44，等于相差1个单体PEG的质量，计算得TME分子量为1 540.948 8。TME为VES(分子量为530.78)与PEG 1000聚合而成，与检测结果相符。
TDE对照品：ESI-MS m/z 1 007.157 7 [M+2H]+信号最强，相邻信号质荷比差值为 44，等于相差1个单体 PEG的质量，计算得 TDE分子量为2 012.315 4。TDE为VES与PEG 1000以2∶1的比例聚合而成，与检测结果相符。
2.2.2 核磁共振光谱 将制备得到的 TME、TDE对照品测定1H-NMR、13C-NMR、DEPT(135°)。谱图见图2～3，信号归属见表1～4。
图2 1H-NMR 数据分析
A-TME；B-TDE；C-TME氢谱；D-TDE氢谱。
Fig. 2 1H-NMR spectrum data analysis
A-TME；B-TDE；C-1H-NMR spectrum of TME；D-1H-NMR spectrum of TDE.
图3 13C-NMR 数据分析
A-TME；B-TDE；C-TME碳谱；D-TDE碳谱。
Fig. 3 13C-NMR spectrum data analysis
A-TME；B-TDE；C-13C-NMR spectrum of TME；D-13C-NMR spectrum of TDE.
表1 1H-NMR 数据及信号归属(TME)
Tab. 1 Data of 1H-NMR and signal attribution(TME)
表2 1H-NMR 数据及信号归属(TDE)
Tab. 2 Data of 1H-NMR and signal attribution(TDE)
表3 13C-NMR 数据及信号归属(TME)
Tab. 3 Data of 13C-NMR and signal attribution(TME)
表4 13C-NMR 数据及信号归属(TDE)
Tab. 4 Data of 13C-NMR and signal attribution(TDE)
1H-NMR图中，TME在δ 2.622～2.753处具有活泼氢的信号，TDE中则没有；TDE中由VES引入的质子数是TME中的2倍。
13C-NMR图中，TME中与-OH相连的 2个CH2在δ 61.71、72.51处有信号，在TDE中由于结构完全对称，这2个CH2的信号分别与对称位置的CH2信号峰重叠。
2.3 TME和TDE对照品纯度测定及TME、VES、TCP、TDE含量测定
2.3.1 色谱条件 色谱柱：Waters XBridge C8色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.1%甲酸溶液为流动相A，乙腈-异丙醇(1∶1)为流动相B，梯度洗脱(0～7 min，65%→100%B；7～13 min，100%B；13～13.5 min，100%→65%B；13.5～18 min，65%B)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35℃；检测波长：285 nm；进样量：20 μL。
2.3.2 溶液制备 ①TME供试品溶液：精密称取TME适量，用乙腈溶解并稀释制成 6 mg·mL-1的溶液，摇匀即得。②TDE供试品溶液：精密称取TDE适量，用乙腈溶解并稀释制成3 mg·mL-1的溶液，摇匀即得。③对照品溶液：精密称取TME、VES、TCP、TDE的对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成各含约 3，0.09，0.09，0.6 mg·mL-1的混合溶液，摇匀即得。④供试品溶液：精密称取TPGS供试品30 mg，置10 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
2.3.3 TME和 TDE对照品纯度测定 TME及TDE供试品溶液分别按“2.3.1”项下色谱条件测定，采用面积归一化法计算，得到TME的纯度为99.1%，TDE的纯度为99.8%，色谱图见图4。
图4 TME，VES，TCP，TDE含量测定高效液相色谱图
A-TME供试溶液；B-TDE供试溶液；C-供试品溶液；D-对照品溶液；1-TME；2-VES；3-TCP；4-TDE。
Fig. 4 HPLC chromatograms of determination of TME，VES，TCP，TDE
A-TME solution; B-TDE solution; C-sample solution; D-standard solution; 1-TME; 2-VES; 3-TCP; 4-TDE.
2.3.4 专属性 将对照品溶液与供试品溶液按“2.3.1”项下条件进样测定，色谱图见图4。结果表明TPGS中各组分分离良好，专属性能够满足测定要求。
2.3.5 线性关系和范围 分别精密称取 TME，VES，TCP，TDE对照品 750，22.5，22.5，150 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性储备溶液。精密量取线性储备溶液适量，加乙腈稀释，制成 TME质量浓度分别为149.4，373.4，1 493，2 240，2 987，4 481 μg·mL-1，VES质量浓度分别为4.550，11.37，45.50，68.25，90.99，136.5 μg·mL-1，TCP 质量浓度分别为 4.466，11.16，44.66，66.99，89.32，134.0 μg·mL-1，TDE质量浓度分别为 30.52，76.30，305.2，457.8，610.4，915.6 μg·mL-1的系列混合溶液。按“2.3.1”项下条件进样测定，以质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得到TME的回归方程为Y=1.432 7X+25.196，r=0.999 8，VES的回归方程为Y=4.178 6X-0.135 6，r=1.00 0，TCP的回归方程为Y=7.279 4X-3.165 9，r=1.00 0，TDE的回归方程为Y=2.032 7X-4.99 7，r=0.999 5，结果表明各组分在质量浓度范围内线性关系良好。
2.3.6 检测限和定量限 将对照品溶液逐级稀释，按“2.3.1”项下条件进样测定，取信噪比10∶1为定量限，信噪比3∶1为检测限。结果表明TME，VES，TCP，TDE的定量限分别为7.468，0.909 9，0.446 6，6.104 μg·mL-1，检测限分别为 2.240，0.182 0，0.134 0，1.221 μg·mL-1。
2.3.7 仪器精密度试验 将对照品溶液按“2.3.1”项下条件连续进样6次，测得TME，VES，TCP，TDE峰面积的 RSD(n=6)分别为 0.05%，0.26%，0.14%，0.05%，表明仪器精密度良好。
2.3.8 重复性试验 取 TPGS(批号：20111103)样品，按“2.3.2”项下方法平行配制 6份供试品溶液，按“2.3.1”项下条件进样测定。TME，VES，TCP，TDE的平均含量(n=6)分别为82.0%，0.04%，0.19%，12.3%，RSD(n=6)分别为0.46%，1.32%，0.60%，0.46%，表明方法重复性良好。
2.3.9 回收率试验 精密称取TME，VES，TCP，TDE对照品62.5，22.5，22.5，75.0 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为回收率储备液。另取 TPGS(批号：20111103)约30 mg，置10 mL量瓶中，共称取12份，分别加入回收率储备液1，2，3，8 mL，作为4个浓度水平，每个浓度水平平行配制 3份，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，按“2.3.1”项下条件进样测定，TME以第1，3，4浓度水平计算平均回收率，VES，TCP，TDE以第1，2，3浓度水平计算平均回收率。TME，VES，TCP，TDE 的平均回收率(n=9)分别为98.8%，98.4%，99.7%，99.3%，RSD分别为1.41%，0.37%，1.32%，1.31%。
2.3.10 稳定性试验 将供试品溶液在常温下放置，分别于0，2，4，6，8，12，24 h依法取样测定，测得TME，VES，TCP，TDE峰面积的RSD分别为0.46%，1.82%，1.07%，1.15%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.11 样品测定 取 3批供试品分别依法测定TME，VES，TCP，TDE的含量，结果见表5。
2.4 PEG 1000含量测定
2.4.1 色谱条件 色谱柱：Waters XBridge C8色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.1%甲酸溶液为流动相A，乙腈-异丙醇(1∶1)为流动相B，梯度洗脱(0～4 min，45%B，4～5 min，45%→100%B，5～12 min，100%B，12～12.1 min，100%→45%B，12.1～17 min，45%B)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：8 μL；蒸发光散射检测器条件(高温不分流模式)：漂移管温度 90.4 ℃，载气流速2.3 L·min-1。
2.4.2 溶液制备 ①对照品溶液：精密称取PEG 1000对照品适量，加乙腈溶解并稀释制成约含0.06，0.3，0.6 mg·mL-1的溶液，摇匀，作为对照溶液1～3。②供试品溶液：精密称取TPGS供试品30 mg，置10 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀即得。
2.4.3 专属性 将对照品溶液，供试品溶液按“2.4.1”项下条件进样测定，色谱图见图5。结果表明专属性良好。
图5 PEG 1000测定高效液相色谱图
A-对照品溶液；B-供试品溶液；1-PEG 1000；2-TME；3-TDE。
Fig. 5 HPLC chromatograms of determination of PEG 1000
A-standard solution；B-sample solution；1-PEG 1000；2-TME；3-TDE.
2.4.4 线性和范围 精密称取 PEG 1000对照品150 mg，置50 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为线性储备溶液。精密量取线性储备溶液适量，加乙腈稀释，制成PEG 1000质量浓度分别为 9.065，18.13，60.44，120.9，181.3，302.2，483.5，604.4 μg·mL-1的系列溶液。按“2.4.1”项下条件进样测定，以质量浓度(μg·mL-1)的对数X为横坐标，峰面积的对数Y为纵坐标，进行线性回归，PEG 1000回归方程为Y=1.738 8X+2.151 3，r=0.999 5，结果表明PEG 1000在9.065～604.4 μg·mL-1内线性关系良好。
2.4.5 检测限和定量限 将对照品溶液 1逐级稀释，按“2.4.1”项下条件进样测定，取信噪比10∶1为定量限，信噪比 3∶1为检测限。结果表明PEG 1000 的定量限为 9.065 μg·mL-1，检测限为4.533 μg·mL-1。
2.4.6 仪器精密度试验 将对照品溶液1按“2.4.1”项下条件连续进样6次，测得PEG 1000峰面积的RSD(n=6)为0.67%，表明仪器精密度良好。
2.4.7 重复性试验 取 TPGS(批号：20111103)样品，平行配制 6份供试品溶液，按“2.4.1”项下条件进样测定，PEG 1000的平均含量(n=6)为4.99%，RSD(n=6)为1.17%，表明方法重复性良好。2.4.8 回收率试验 精密称取 PEG 1000对照品150 mg，置100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为回收率储备液。另精密称取TPGS(批号：20111103)150 mg置50 mL量瓶中，称取9份，分别加入回收率储备液1，5，10 mL，作为3个浓度水平，每个浓度水平平行配制3份，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，按“2.4.1”项下条件进样测定，计算平均回收率。PEG 1000的平均回收率(n=9)为98.2%，RSD为0.87%。
2.4.9 稳定性试验 将供试品溶液在常温下放置，分别于0，2，4，8，12，24 h依法取样测定，测得PEG 1000峰面积的RSD为1.09%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.4.10 样品测定 取 3批供试品分别依法测定PEG 1000的含量，结果见表5。
表5 样品中5种成分含量测定结果(n=3)
Tab. 5 Results of determination of five components(n=3)
3 讨论
3.1 TME，TDE制备方式及洗脱液选择
TPGS的纯化[14]与其中单双酯的分离[15]可见文献报道，但均使用正相体系硅胶柱层析，很难得到高纯度的TME与TDE。本实验使用反相制备液相色谱仪，考察了乙腈-异丙醇-水，乙腈-乙醇-水和乙醇-水等洗脱体系，结果显示，在同等上样量时使用乙醇-水梯度洗脱得到的TME，TDE纯度最高，且该洗脱体系对环境较为友好。
TPGS中主要成分为TME，TDE含量相对较少，若直接分离制备TDE对照品，制备效率较低。可将 TPGS与VES按约 1∶1的比例反应，或将PEG 1000与VES按约1∶2的比例反应，得到TDE含量较高的供试品，然后再分离制备TDE对照品，可提高收率，降低成本，且环保低碳。
3.2 检测器及参数选择
TME，VES，TCP，TDE分别在285，293 nm处有最大紫外吸收，为使 4种成分在同一条件下有最大吸收，最终选择 285 nm作为检测波长。PEG 1000无紫外吸收且不易挥发，选择高温不分流模式的 ELSD检测器，根据流动相组成确定ELSD检测器的初始参数为漂移管温度91.4 ℃，载气流速 2.5 L·min-1，逐步降低温度和流速考察样品的检测情况，在基线噪声符合要求的情况下得到待测组分的最大峰面积，最终确定漂移管温度 90.4 ℃，载气流速 2.3 L·min-1。
3.3 色谱柱选择
考察了 5根不同型号的色谱柱(SHISEIDO CAPCELL PAK C18，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18，Waters XBridge Shield RP18，Waters XBridge C8，Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8)，规格均为4.6 mm×250 mm，5 μm，结果显示Waters XBridge C8色谱柱在获得良好分离度的同时拥有最佳的检测灵敏度，色谱图见图6。
3.4 流动相选择
选择乙腈、甲醇、乙腈-乙醇(1∶1)、乙腈-异丙醇(1∶1)等有机相分别与 0.1%甲酸进行梯度洗脱，结果显示乙腈-异丙醇(1∶1)与 0.1%甲酸梯度洗脱时，各组分分离度均＞2.0，柱效相对最优，含量较低组分(VES，TDE，TCP)能够得到最佳的检测灵敏度。
3.5 耐用性考察
比较了不同柱温(30，35，40 ℃)，不同流速(0.9，1.0，1.1 mL·min-1)对样品检测的影响，结果显示各组分的分离度均＞2.0，含量结果 RSD均＜5.0%，方法的耐用性良好，适用于TPGS中5种成分的含量测定。
图6 色谱柱考察高效液相色谱图
A-Waters XBridge C8色谱柱；B-Waters XBridge Shield RP18色谱柱；C-Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱；D-SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱；E-Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱；1-TME；2-VES；3-TCP；4-TDE。
Fig. 6 HPLC chromatograms of choosing columns
A-Waters XBridge C8 column； B-Waters XBridge Shield RP18 column； C-Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 column； D-SHISEIDO CAPCELL PAK C18 column； E-Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8 column； 1-TME； 2-VES； 3-TCP； 4-TDE.
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