花生四烯酸乙醇胺(anandamide，AEA)是第一个被发现并从体内分离出来的内源性大麻素，前期研究发现脑胶质瘤中 AEA的代谢酶脂肪酸酰胺水解酶(fatty acid amide hydrolysis，FAAH)的表达与肿瘤病理级别呈负相关[1]，但脑组织中内源性大麻素2-花生四烯酸甘油(2-arachidonylglycerol，2-AG)含量远高于AEA，故探讨2-AG代谢酶单酰甘油脂肪酶(monoacylglycerol lipase，MAGL)在胶质瘤组织中的表达情况及其与病理级别的相关性更具意义。
1 仪器与试剂
7300 型荧光定量 PCR 仪(美国 ABI)；1200型液相色谱仪、5975B inert XLMSD 型气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent)；3200 Q Trap 型质谱仪(美国 ABI)；2-oleoylglycerol(美国 Sigma-Aldrich，批号：M2787)；Trizol(美国 Invitrogen，批号：15596026)；ReverTra Ace® qPCR RT Kit(日本ToYoBo，批号：F0921K)；SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(日本TaKaRa，批号：DRR081A)；引物(上海生工生物工程有限公司)。
2 组织标本
选择舟山医院神经外科2012年1月—2016年1月首次手术切除并经病理检查证实为脑胶质瘤的组织标本23例，患者无神经精神疾病史和毒物接触史，术前均未行放疗、化疗和免疫治疗；对照组 8例，均为脑挫裂伤行内减压术切除的正常脑组织。一部分标本用甲醛溶液固定后作病理学和免疫组化，按照WHO神经系统肿瘤分类分级标准(2007版)进行分级：Ⅰ级1例，Ⅱ级7例，Ⅲ级5例，Ⅳ级10例。另一部分用标本液氮速冻，-80 ℃冰箱保存，留作基因及酶活性检测。本研究纳入统计学的组织标本分为3组：正常脑组织组(8例)、低级别脑胶质瘤组(WHO ～ⅠⅡ级，8例)和高级别脑胶质瘤组(WHO ～ⅢⅣ级，15例)。
3 方法
3.1 实时荧光定量PCR检测
按照文献[1]的实验方法进行。①组织总RNA的提取：液氮下研钵粉碎组织块，按照Trizol试剂说明书推荐的步骤操作。②cDNA的合成：使用ReverTra Ace® qPCR RT Kit进行逆转录反应，总反应体系为10 μL，所有操作均在冰上完成，混匀放置于PCR后37 15℃ min、98 5℃ min、4 ℃10 min，即得到逆转录产物(cDNA)，加灭菌纯水稀释至 10倍，-20 ℃保存备用。③RT-PCR：以cDNA为模板进行扩增。GAPDH引物正义：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’； 反 义 ：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。MAGL 引物正义：5’-CATGTGGATTCCATGCAGAAAG-3’；反义：5’-AGGATTGGCAAGAACCAGAGG-3’。
PCR所用试剂为SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒，反应体系为20 μL。置于PCR仪上按下列条件扩增：95 30℃ s预变性，95 5℃ s、60 ℃31 s，扩增40个循环，然后95 15℃ s、60 1℃ min、95 15℃ s。PCR完成后，调整基线循环和计算域值，根据标准曲线，ABI 7300 System SDS Software软件进行分析，计算出待测基因的表达水平，将待测基因的表达量/管家基因 GAPDH表达量的值进行统计分析。
3.2 MAGL活性测定
参照文献[1-2]所述方法进行 MAGL活性测定(略有改动)。LC-MS条件：Agilent 1200 series型液相色谱仪，ABI 3200 Q TrapLC/MS/MS system型质谱仪，Agilent ZOR BAX Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，1.8 μm)，柱温保持在 40 ℃，进样量为 5 μL，流动相 A 为水(含 0.25%醋酸和5 mmol·L-1醋酸铵)，流动相 B 为甲醇，流速为0.6 mL·min-1，95%B 洗脱 5 min。质谱为 ESI(–)离子源，干燥气为N2，温度为350 ℃，扫描质量范围为50～400 amu。按照BCA法测定组织蛋白的浓度，用80 μg蛋白进行MAGL活性测定：在50 mmol·L-1 Tris-HCL(pH 8.0) 含有0.05% BSA的缓冲液中加入80 μg 蛋白、25 μmol·L-1 反应底物 2-oleoylglycerol(2-OG)混合均匀，在37 ℃下反应30 min，随后加入含有 1 nmol 17∶0 脂肪酸内标的甲醇终止液200 μL终止反应，LC-MS分析水解反应产物含量。结果以17∶0 脂肪酸(m/z=269)作为内标对MAGL水解产物油酸(m/z=281)进行定量分析。
3.3 统计学方法
采用SPSS 14.0统计软件，计量数据以x±s表示，组间比较采用Kruskal-Wallis H检验。MAGL mRNA、MAGL活性与脑胶质瘤病理级别的相关性采用 Spearman相关分析。MAGL mRNA与MAGL活性的关系采用Pearson相关分析。
4 结果
4.1 MAGL表达水平和MAGL活性在正常脑组织和胶质瘤组织中的表达情况
因正常脑组织和脑胶质瘤组织均含有 MAGL及其底物 2-AG，且 FAAH 酶也能部分水解2-AG[2]，因此在MAGL活性测定时加入了 FAAH酶的抑制剂URB597。每个样本再加入外源性底物2-AG以测定组织MAGL活性，每个组织样本测3次以减少实验误差，设立1个不加外源性2-AG 的空白对照组，3次测得的酶活性减去空白对照组酶活性所得的数据纳入统计学计算，结果见表1。所有组织中均能检测到MAGL mRNA的表达，在正常脑组织中呈高表达，而在脑胶质瘤组织中呈低表达，差异有统计学意义(P＜0.01)，并且 MAGL mRNA的表达量与胶质瘤的病理级别呈负相关(r=-0.73，P＜0.01)；此外，所有组织中还可检测到MAGL活性，正常脑组织MAGL活性明显高于脑胶质瘤组织，差异也有统计学意义(P＜0.01)，并且MAGL活性与胶质瘤的病理级别也呈负相关(r=-0.63，P＜0.01)。
表1 正常脑组织和各级别胶质瘤组织中MAGL的表达水平
Tab. 1 The MAGL expression of normal brain tissue and glioma tissue
4.2 MAGL 表达水平与MAGL活性的关系
将每个组织样本的 MAGL mRNA/GAPDH mRNA的值与该组织的 MAGL活性进行 Pearson相关分析，MAGL 表达水平与MAGL活性之间具有明显的正相关关系(r=0.49，P＜0.05)。结果见图 1。
图1 MAGL mRNA表达水平与MAGL活性的关系
Fig. 1 The relationship between MAGL mRNA and MAGL activity
5 讨论
MAGL是一个胞浆酶，在脂代谢及大麻素系统中有重要的生理作用，研究上述 2种系统对恶性肿瘤的影响成为肿瘤领域研究的热点问题。2010年Nomura的研究团队在《Cell》上提出了一条关于肿瘤细胞生长和侵袭的全新信号通路，即MAGL-FFA-LPA/PGE2/LPE/PA 通路[3]。Guida等[4]对16 例健康女性和与之配对的18例子宫内膜癌患者进行对比分析，采用Western blot检测技术，发现正常女性子宫内膜中MAGL蛋白的表达明显高于子宫内膜癌患者。同时，运用LC-MS检测发现，2-AG在正常子宫内膜组织和内膜癌组织中的表达是有差异的，子宫内膜癌组织中的表达明显高于正常组织。随后，Ye等[5]研究发现，MAGL蛋白在结直肠癌组织中高表达，药理学上抑制MAGL活性或基因干扰MAGL的表达能抑制肿瘤细胞的生长及侵袭，凋亡的肿瘤细胞增多，细胞内CyclinD1和Bcl-2基因表达减少。Ma等[6]发现，应用JZL184特异性抑制结直肠癌细胞MAGL的表达，可引起基因Bax/Bcl-2表达增多，导致细胞凋亡。同时，在上皮-间质转化实验中发现，钙黏附蛋白E表达增多，波形蛋白及锌指蛋白SNAI1减少，增强了肿瘤细胞的侵袭性及转移能力。此外，还发现JZL184可提高肿瘤细胞对5-Fu化疗的敏感性。秦易等[7]运用免疫组化发现 MAGL主要集中表达在肝癌组织的细胞核中，在肝癌组织中的表达高于癌旁组织及正常组织。Western blot结果显示，MAGL与肿瘤恶性程度呈正相关，其高表达也许是肝癌的恶性表型之一。Zhu等[8]也发现，MAGL的表达在肝癌组织中显著高于周边的癌旁组织，且与肿瘤大小、低分化、微血管侵犯、TNM分期呈正相关。高表达MAGL蛋白的肝癌患者表现出更差的临床预后，其 5年生存率明显低于低表达MAGL蛋白的肝癌患者，肿瘤复发的概率明显高于后者。因此，提出MAGL可以作为肝癌患者预后的独立检测指标。在EMT实验中，该研究团队进一步发现MAGL可通过NF-κB信号通路促进肿瘤细胞的生长及侵袭。
本研究结果显示，在脑胶质瘤组织中，无论在基因水平还是在蛋白水平均可检测到 MAGL的表达，MAGL的表达明显低于正常脑组织，并且与胶质瘤的病理级别呈负相关。该结果与上述大多数恶性肿瘤表达情况不一致，推测在胶质瘤中，内源性大麻素2-AG及其配体CB2受体异常高表达[9]，而胶质瘤细胞为了维持其高侵袭性，一方面通过分解大量的脂质来提高 FFAs水平，促使下游促癌因子的释放；另一方面通过分解内源性大麻素 2-AG，抑制CB2 受体的作用，上述2个过程中作为关键酶的 MAGL均被消耗，因此导致高级别胶质瘤中MAGL的表达更低，这也从另一种角度证实Nomura 的观点：MAGL 是通过调控脂肪酸系统赋予癌细胞侵袭性，而非 MAGL 自身的作用。由此可以推测，MAGL参与了脑胶质瘤的发生、发展过程，检测 MAGL的表达可评价脑胶质瘤的恶性行为，为脑胶质瘤的临床治疗和预后提供参考依据。目前，MAGL已成为肝癌治疗的一个新的治疗靶点及预后指标[10]，因此，深入探讨 MAGL 在脑胶质瘤发生、发展中的致病机制具有深远的意义。
REFERENCES
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