糖尿病是常见的代谢异常综合征，与遗传和环境因素存在一定的联系[1]，而糖尿病肾病是常见的微血管并发症，与高血糖及血流动力学障碍所致炎症存在一定的相关性。研究显示，糖尿病炎性损伤包括高水平的炎症因子表达及炎症信号通路的激活，其中TLR4/NF-κB信号通路对肾组织病变起着重要的介导作用[2]。依普利酮作为新型选择性醛固酮拮抗剂，无性激素抑制的不良反应，大量临床研究及动物实验表明，其对于糖尿病肾病有确切疗效。既往的研究均着重于依普利酮的疗效及不良反应，对其机制研究较少。糖尿病肾病模型是一种与人类糖尿病肾病相似的典型动物模型，有关选择性醛固酮拮抗剂对该模型疗效和治疗机制的研究较多。本研究通过探讨依普利酮对糖尿病肾病模型大鼠 TLR4/NF-κB信号通路的影响，探讨其可能的作用机制。
1 材料及仪器
1.1 动物
40只健康SPF级4周龄SD大鼠，♂，体质量(80～100)g，由河南省实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK(豫)2010-0002。
1.2 试剂和仪器
依普利酮(大连美仑生物技术有限公司，货号：MB1444-S)；链脲佐菌素(STZ，Sigma公司，批号：S0130)；IL-6、TNF-α 和 MCP-1 ELISA 试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：150911，151102，150903)；TLR4(货号：19811-1-AP)、NF-κB p65(货号：10745-1-AP)、兔抗大鼠多克隆抗体(美国Proteintech公司)；MCP-1试剂盒(美国RND公司，批号：R002365L)。
ALC-V8动物呼吸机(上海奥尔科特公司)；全自动生化分析仪(日本HITACHI公司)；ST-360酶联免疫检测仪(上海科华实验系统有限公司)；Light cycle® 96实时荧光定量PCR仪[罗氏诊断产品(上海)有限公司]；Geldoc 2000凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。
2 方法
2.1 动物模型的建立
40只大鼠禁食不禁水12 h后，随机选择30只采用10%水合氯醛(2 mL·kg-1)腹腔注射麻醉，行右肾摘除术；余下10只为正常组，行右肾摘除假手术。术后青霉素(2万单位)肌注，每天1次，连续3 d。手术6 d后，大鼠尾静脉注射STZ(45 mg·kg-1，0.1 mmol·L-1柠檬酸缓冲液溶解，pH 4.4)。正常组尾静脉注射柠檬酸缓冲液(5 mL·kg-1，pH 4.4)。72 h后测定空腹血糖，血糖＞16.7 mmol·L-1即为糖尿病模型。1周后，复测血糖，并收集24 h尿液，血糖＞16.7 mmol·L-1、24 h 尿蛋白＞造模前的 50%即为糖尿病肾病模型[3]。
2.2 动物分组和给药
按成人 1日剂量折算出大鼠等效剂量。选择符合诊断标准的成模大鼠30只，随机分成模型组、依普利酮组(40 mg·kg-1)、阳性对照组(缬沙坦，20 mg·kg-1)，另设正常组。各治疗组每天灌胃给药1次，模型组和正常组给予2 mL·kg-1生理盐水灌胃，连续治疗 8周。试验期间，除正常组外，每组各死亡1只，予以剔除。
2.3 标本收集
给药第8周末，收集大鼠24 h尿液，-80 ℃低温保存备用；禁食12 h，腹主动脉取血6 mL，其中EDTA抗凝管3 mL，检测糖化血红蛋白水平，促凝管内3 mL，检测肌酐水平。颈椎脱位法处死大鼠，取出左侧肾脏，1/2采用10%甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，行HE染色。1/2于-80 ℃低温保存备用。
2.4 观察指标
全自动生化分析仪检测24 h尿蛋白、血肌酐及血糖化血红蛋白水平；肾组织加入生理盐水于冰水浴中进行组织匀浆，取上清，ELISA法测定IL-6、TNF-α和MCP-1水平。
2.5 qPCR检测TLR4、NF-κB p65 mRNA水平
Trizol提取总RNA，取2 µg RNA按照试剂盒说明书逆转录合成cDNA。引物序列由上海英骏公司提供。TLR4 上游序列：5′-TGGCAGTTTCTGAG TAGCCG-3′，下游序列：5′-GCTACTTCCTTGTGC CCTGT-3′，产物：389 bp；NF-κB p65 上游序列：5′-CCCCCAACTTCTTTGGGTGA-3′，下游序列：5′-CCTAGGAGCGTTGCTTTGGA-3′，产物：326 bp；内参GAPDH上游引物：5′- TGTGAACGGATTTG GCCGTA-3′，下游引物：5′- GATGGTGATGGGTT TCCCGT-3′，产物：208 bp。PCR 采用 20 μL的反应体系，选择 SYBR Green试剂盒，采用 Light cycle® 96实时荧光定量PCR仪进行基因扩增。计算基因的相对表达量(相对表达量=2-ΔΔCt×100%，ΔCt=Ct(待测基因)-Ct(GAPDH)。
2.6 Western blot法检测 TLR4、NF-κB p65 蛋白水平
取肾组织，常规方法[4]提取蛋白质，考马斯亮蓝染色(Bradford)法测定总蛋白的含量。蛋白样品行SDS-PAGE电泳，PVDF膜转膜2 h。5%脱脂奶粉封闭；加入 TLR4(1︰1 000)、NF-κB p65(1︰2 000)一抗4 ℃孵育过夜，二抗(羊抗兔)室温孵育2 h。行ECL反应，显色。Bio-Rad凝胶成像系统拍照，GIS凝胶成像分析软件分析。
2.7 统计学方法
运用SPSS 13.0进行统计学处理，计量数据采用x± s 表示，组间比较采t检验。计数资料用百分比表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义｡
3 结果
3.1 一般状态
与正常组比较，模型组大鼠出现多饮、多食、多尿、体质量减轻等明显的糖尿病症状。阳性对照组、依普利酮组大鼠经过治疗后，症状较模型组均有所改善，体质量明显增加，见表1。
3.2 24 h尿蛋白、血肌酐及血糖化血红蛋白水平比较
治疗后，阳性对照组、依普利酮组大鼠 24 h尿蛋白、血肌酐及血糖化血红蛋白水平较模型组均明显下降，均有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)，见表1。
表1 大鼠体质量、24 h尿蛋白、血肌酐及血糖化血红蛋白水平比较(x± s )
Tab. 1 Comparison of rat body weight, 24 h urinary protein, serum creatinine and blood glucose hemoglobin levels (x± s )
注：与正常组比较，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.05，3)P＜0.01。
Note: Compared with normal group, 1)P ＜0.01; compared with model group, 2) P＜0.05, 3)P＜0.01.
3.3 HE染色行肾组织病理形态学观察
正常组大鼠肾小球结构清晰，基底膜、系膜区基质、系膜细胞及内皮细胞水平正常；而糖尿病肾病大鼠肾小球体积增大，并出现分叶。基底膜、系膜区基质均明显增加，肾小管上皮细胞伴有空泡样变性，肾间质出现炎性细胞浸润。与模型组比较，阳性对照组、依普利酮组大鼠的肾小球体积改善，空泡样变性和浸润明显减轻。结果见图1。
图1 HE 染色行肾组织病理形态学观察(400×)
Fig. 1 Pathological observation of renal tissue in HE staining line(400×)
3.4 IL-6，TNF-α和MCP-1水平比较
治疗后，阳性对照组、依普利酮组大鼠肾组织IL-6、TNF-α和MCP-1水平较模型组均明显下降，有统计学差异(P＜0.05或 P＜0.01)。结果见表 2。
表2 IL-6、TNF-α和MCP-1水平比较(x± s )
Tab. 2 Comparison of IL-6, TNF-α and MCP-1 levels (x± s )
注：与正常组比较，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.05，3)P＜0.01。Note: Compared with the normal group, 1) P＜0.01; compared with the model group, 2)P＜0.05, 3)P＜0.01.
3.5 TLR4、NF-κB p65 mRNA表达水平比较
治疗后，阳性对照组、依普利酮组大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65 mRNA水平较模型组明显下降，均有统计学差异(P＜0.01)。结果见图2。
图2 大鼠肾组织TLR4，NF-κB p65 mRNA水平比较
与正常组比较，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.01。
Fig. 2 Comparison of TLR4 and NF-κB p65 mRNA levels in rat kidney
Compared with normal group, 1)P＜0.01; compared with model group,2)P＜0.01.
3.6 TLR4、NF-κBp65蛋白水平比较
治疗后，阳性对照组、依普利酮组大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65水平较模型组明显下降，均有统计学差异(P＜0.01)。结果见图3。
图3 大鼠肾组织TLR4、NF-κBp65蛋白水平比较
与正常组比较，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.01。
Fig. 3 Comparison of TLR4 and NF-κB p65 protein levels in rat kidney
Compared with the normal group, 1)P＜0.01; compared with the model group, 2)P＜0.01.
4 讨论
高血糖易增厚肾小管基底膜，促进细胞外基质的积聚，改变肾小球和肾小球细胞膜结构及功能，诱发肾损伤并发症，严重时出现尿蛋白。研究表明，糖尿病肾病的发生与晚期糖基化终产物的累积、炎症反应等途径有关，增加血小板凝聚，破坏机体的微循环[5]。研究显示，醛固酮拮抗剂抗炎、抗纤维化效果明显，能降低尿蛋白水平，改善肾小球硬化，但对性激素具有一定的抑制作用。依普利酮是一种新型醛固酮拮抗剂，对性激素水平的影响较小。Tsuboi等[6]研究发现依普利酮能显著降低非糖尿病肾病患者的尿蛋白水平，并认为长期低剂量的依普利酮对持续尿蛋白患者具有保护作用。本研究通过肾组织病理形态学观察发现，依普利酮能有效改善大鼠肾小球体积，减轻空泡样变性和浸润，下调24 h尿蛋白、血肌酐及血糖化血红蛋白水平，提示依普利酮对糖尿病肾病引起的肾损伤具有一定的修复作用，进而保持机体内环境稳定。
有研究显示，长期过度分泌炎症因子，对肾小球具有一定的破坏作用，严重时导致细胞外基质堆积和肾小球硬化[7]。本研究显示，依普利酮组大鼠经过治疗后，IL-6、TNF-α和MCP-1水平较模型组均明显下降，说明依普利酮具有一定的抗炎作用，对糖尿病肾病有一定的治疗和预防作用，这也提示依普利酮能有效地改善靶器官损伤和血管内皮功能，降低进行性炎症，减少纤维化的发生。TLR4是一种重要的机体免疫和炎症识别系统的跨膜蛋白受体，能识别并结合炎症刺激因子，诱导炎症因子及部分细胞因子的释放。研究报道，糖尿病肾病大鼠的肾组织中TLR4水平明显增加，并与蛋白尿等指标相关[8]。NF-κB是一种转录调节因子，包含p50和p65组成的同源或异源二聚体，对调控机体的免疫功能和炎症反应，发挥着重要作用[9]。研究证实，TLR4激活受体后，通过信号传导激活 NF-κB，诱发炎症介质网络失衡，加重机体的炎症反应，导致尿蛋白的发生，TLR4表达的多少同时又受到 IL-6、TNF-α、MCP-1 和 NF-κB等细胞因子的调控，形成了复杂的正反馈持续激活的网络环路[10]。本研究结果显示，依普利酮能下调大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65 mRNA水平，减少TLR4、NF-κB p65蛋白表达，提示依普利酮可能通过降低大鼠肾组织TLR4、NF-κB p65水平，抑制炎症因子释放，减缓并发症的进展，改善肾损伤和肾功能。
总之，依普利酮能有效地改善糖尿病肾病大鼠的炎症水平，其机制可能与下调患病大鼠IL-6、TNF-α、MCP-1、TLR4、NF-κB p65 的水平有关。
REFERENCES
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