脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemiareperfusion injury，I/R)严重危害患者的身体健康，有较高的致死致残率。其发病机制复杂，与氧化损伤、炎症损伤、兴奋性氨基酸毒性、钙超载等多种机制相关[1]。I/R发生后，神经元的损伤、凋亡严重影响患者愈后及未来的生存质量。神经元的凋亡与氧化应激关系密切，抗氧化治疗可以降低氧化应激带来的损伤，从而降低神经元的凋亡[2]。
刺芒柄花素(formononetin，FOR)是红车轴草的主要有效成分，属于异黄酮类成分。FOR具有多种药理活性，如抑制肿瘤、抗氧化、抗高血压及雌激素样作用[3]。有研究发现，FOR对缺血再灌注损伤的肾脏具有保护作用，其机制与抗氧化有关[4]。FOR在I/R中的作用还未曾有文献报道，因此本研究根据FOR对I/R的保护作用进行研究，并探讨其可能的机制。
1 材料
1.1 动物
50只健康成年 SD大鼠，♂，体质量(250±20)g，SPF级，购自重庆医科大学动物实验中心，实验动物许可证号：SYXK(渝)2012-0001，本批次大鼠合格证号：0001813，SPF级饲养条件。
1.2 药物和试剂
FOR(陕西慈缘生物技术有限公司，批号：20160423；含量≥98%)，将FOR溶解于蒸馏水中，配成25 mg·mL-1的溶液，备用；NO及NOS试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为20151112、20160105)；caspase-3，Bcl-2、Bax 及β-actin抗体(美国Cell Signaling Technology公司，批号：20160220、20160304、20160328)。
1.3 仪器
DB096型大鼠跳台(安徽正华)；ELx808型酶标仪(美国 BioTek公司)；170-1870型凝胶成像系统(美国 Bio-Rad公司)；AL104型电子天平(Mettler-Toledo公司)；DYCZ-24DN型Western blot垂直电泳仪(北京六一生物科技有限公司)。
2 方法
2.1 分组与干预
将大鼠随机分为假手术组、I/R组、FOR高、中、低剂量组(100，50，20 mg·kg-1)，每组10只。FOR各组于造模前每日分别灌胃 100，50和20 mg·kg-1的FOR溶液，连续灌胃7 d，每日1次，同时假手术组和I/R组灌胃相应体积的蒸馏水。
2.2 大鼠I/R模型的制备
4%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，仰卧固定于鼠板上，颈部除毛，参考文献[5]的MCAO法，将大鼠颈中剪1 cm长切口，分离右侧颈总、颈外和颈内动脉。分离后用手术线将颈总动脉扎紧，再将颈外动脉Y型分离处用手术线扎紧。在颈总动脉上开一V型小口，将准备好的线栓从颈总动脉缓慢插入颈内动脉，感到阻力后停止，再将线栓捆绑固定颈内动脉内，缝合伤口。大鼠脑缺血2 h后，拔出线栓，待恢复血供 24 h。假手术组除不插入线栓外，其余方法同。
2.3 神经功能评分
再灌注24 h后，经Longa 5分评分法对大鼠进行神经功能评分。无神经功能障碍，活动正常者记0分；左前肢无法完全伸直者记1分；爬行时向左转圈者记2分；爬行时向左倾倒者记3分；不能行走，意识丧失者记4分。
2.4 跳台法检测学习记忆能力
将大鼠放入跳台箱中，适应2 min。通入40 V的交流电，从大鼠跳入安全平台开始计时，到大鼠从安全平台跳下为止，这段时间记录为大鼠潜伏期。同时，记录300 s内大鼠跳出安全平台后被电击的次数，记为错误次数。所有大鼠于再灌注24 h后进行跳台实验。
2.5 病理组织形态
3.5 %的水合氯醛以 10 mL·kg-1腹腔注射麻醉，迅速断头取脑，放入 10%甲醛的固定液中，石蜡包埋标本，切片厚度为5 μm，进行HE染色，显微镜下观察大鼠海马区域神经细胞的病理组织形态。
2.6 NO含量水平及NOS活性的检测
将行为学评分后的大鼠断头取血，于 4 ℃静置1 h得血清。严格按照NO及NOS试剂盒说明书的步骤进行检测。
2.7 Western blot法检测 caspase-3，Bcl-2、Bax蛋白表达的情况
大鼠断头取脑后，将大脑制成匀浆，严格按照蛋白提取试剂盒的操作步骤，提取脑组织全蛋白，测定浓度。SDS-PAGE凝胶分离蛋白，经PVDF膜转膜，再用脱脂牛奶进行1 h的封闭。分别加入鼠抗caspase-3、Bcl-2和Bax多克隆抗体(1︰250)，孵育过夜，温度为4 ℃，用TBST洗涤3次，每次10 min，洗涤后加入经HRP标记的羊抗兔二抗(1︰500)，孵育2 h，再由TBST液洗涤3次，各10 min。完毕后条带经Bio-RAD凝胶分析仪进行图像扫描分析，灰度值用Quantity One进行测定。caspase-3、Bcl-2和Bax与β-actin的灰度值各自的比值表示caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白相对表达量。
2.8 统计学分析
实验数据结果以x± s 表示，用SPSS 20.0软件进行分析，组间比较采用 t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 大鼠神经功能评分及学习记忆检测结果
假手术组大鼠无神经功能缺损，行为正常；模型组大鼠表现出明显的神经功能损伤症状。与模型组比较，FOR高、中、低剂量组神经功能损伤明显降低。模型组和FOR高、中、低剂量组潜伏期较假手术组明显缩短，错误次数较假手术组明显增多(P＜0.01)。与模型组相比，FOR高、中、低剂量组潜伏期明显延长，错误次数显著减少(P＜0.05 或 P＜0.01)。结果见表 1。
表1 各组大鼠神经功评分及学习记忆的检测结果(n=10,x± s )
Tab. 1 Results of nerve work score and step-down test of rats in each group(n=10,x± s )
注：与假手术组比，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.05，3)P＜0.01。Note: Compared with the sham group, 1)P＜0.01; compared with the model group, 2)P＜0.05, 3)P＜0.01.
3.2 NO水平及NOS活性的检测结果
与假手术组相比，其他各组 NO水平显著升高，NOS活性显著增加(P＜0.01)；与模型组相比，FOR高、中、低剂量组NO水平显著降低，NOS活性显著降低(P＜0.01)，结果见表2。
表2 各组大鼠 NO含量水平及 NOS活性的检测结果(n=10,x± s )
Tab. 2 The content of NO and the detection of NOS activity in rats of each group(n=10,x± s ) U·gprot-1
注：与假手术组比，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.01。
Note: Compared with the sham group, 1)P＜0.01; compared with the model group, 2)P＜0.01.
3.3 病理组织形态结果
模型组细胞的结构和形态异常居多，可观察到细胞肿胀，核固缩。与模型组相比，FOR高、中、低剂量组的脑组织形态显著改善，见图1。
3.4 caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白的表达情况
与假手术组相比，各组caspase-3和Bax蛋白表达显著升高(P＜0.01)，Bcl-2表达显著降低(P＜0.01)；与模型组相比，FOR高、中、低剂量组caspase-3和Bax蛋白表达显著降低(P＜0.01)，Bcl-2表达显著增加(P＜0.01)。结果见表3和图2。
图1 各组大鼠的脑组织HE染色结果(400×)
Fig. 1 HE staining results of brain tissue in each group(400×)
表3 各组大鼠 caspase-3、Bcl-2及 Bax蛋白表达水平的检测结果(n=10,x± s )
Tab. 3 Expression of caspase-3, Bcl-2 and Bax protein in rats of each group(n=10,x± s )
注：与假手术组比，1)P＜0.01；与模型组比较，2)P＜0.01。
Note: Compared with the sham group, 1)P＜0.01; compared with the model group, 2)P＜0.01.
图2 FOR各组大鼠caspase-3、Bcl-2及Bax蛋白表达的Western blot图
Fig. 2 Caspase-3, Bcl-2 and Bax protein expression of FOR rats in each group by Western blot
4 讨论
脑血管疾病日益威胁着人类的健康，已成为人类三大致死病因之一，其中I/R在脑血管疾病中约占 75%。脑缺血损伤的致死、致残率都很高，临床上却没有特效药物，因此，开发I/R的保护药物具有重要意义。线栓法是复制缺血性脑血管疾病的经典方法，该方法具有多种优点：不开颅、创伤小、缺血及再灌时间可控、死亡率低等。在本实验中，运用该方法造模死亡率只有4%，本课题组均在第一时间重新造模进行了实验对象的补充。本研究的目的更侧重于FOR作用机制方面的研究，设置假手术组、模型组及不同剂量的 FOR组已经能完成本研究的目的，因此没有设置阳性对照，但若研究重点更关注药物疗效，则应加设阳性对照组。I/R后，大鼠表现主要为学习记忆力减退、肢体障碍、昏迷、死亡等，可通过神经功能评分来判断造模是否成功，也可以评估药物对神经元的保护作用。由于I/R后大鼠的学习记忆能力会减退，因此可以用跳台法检测大鼠的学习记忆能力。本实验结果表明，FOR可以显著降低 I/R大鼠的神经行为学评分，延长大鼠跳台的潜伏期，减少错误次数，表明FOR显著提升I/R大鼠的学习记忆能力。
在I/R的发生和发展中，NO发挥着毒性和保护的双重作用，低浓度时 NO具有扩张血管的作用，可抑制血小板的聚集，从而改善组织的缺血状况，减轻缺血损伤；在高浓度时，NO具有诱导神经细胞凋亡的作用[6]。NO很不稳定，存在时间很短，由于NO是由NOS催化产生，因此对NOS活性进行检测具有重要的参考意义[7]。I/R后，NOS会过度激活产生大量NO，引起神经毒性，从而导致神经元凋亡[8]。通过本实验发现，FOR能显著降低I/R大鼠的NO含量和NOS活性，这可能是FOR发挥神经保护作用的机制之一。
caspase是特异性凋亡信号转导分子，当caspase被激活后可对细胞执行凋亡程序。caspase-3是caspase家族中最关键的凋亡蛋白酶，对凋亡程序的启动起着重要作用[9]。在神经元的凋亡过程中，Bcl-2也发挥着重要作用，Bcl-2作用于caspase-3的上游，且是caspase-3的底物，因此caspase-3和Bcl-2共同调节着细胞的凋亡过程[10]。当 Bcl-2高表达的时候，能抑制细胞的凋亡，而Bax过度表达时，则促进细胞的凋亡[11]。通过本实验研究发现，FOR能显著抑制caspase-3和Bax蛋白的表达，促进 Bcl-2蛋白的表达，说明 FOR具有显著抑制神经元凋亡的作用。
综上所述，FOR能显著降低 I/R大鼠的神经功能评分、提高大鼠的学习记忆能力，改善脑组织的病理形态，发挥一定的神经保护作用，其机制可能与降低 NO水平并抑制 NOS活性，抑制caspase-3和Bax蛋白的表达，促进Bcl-2蛋白的表达有关。
REFERENCES
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