图1 椿皮高效液相色谱图
李永春1,2，李晓兰2，赵美荣2，赵艳2，张智1*
(1.东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；2.赤峰学院生命科学学院，内蒙古 赤峰 024000)
摘要：目的应用响应面法优化超声辅助提取椿皮中铁屎米-6-酮生物碱的工艺条件。方法以铁屎米-6-酮生物碱提取量为指标，在单因素考察乙醇提取铁屎米-6-酮的基础上，采用中心组合试验设计和响应面分析法优选提取工艺参数。结果最佳提取工艺条件为乙醇浓度68%，液固比32 mL·g-1，超声温度54 ℃，超声时间38 min，铁屎米-6-酮生物碱提取量为26.19 µg·g-1，接近于模型预测值(26.31 µg·g-1)。结论优选的超声提取工艺合理可靠，可为臭椿的开发应用提供实验依据。
关键词：椿皮；铁屎米-6-酮；超声辅助提取；响应面法
椿皮，又称椿根皮、樗白皮，为苦木科臭椿属植物臭椿Ailanthus altissima(Mill.) Swingle的干燥根皮或干皮，是我国传统的中草药，具有清热燥湿、收涩止带、止泻、止血等功效[1]。椿皮的主要活性成分为苦木素类和吲哚生物碱类物质，其吲哚生物碱类多为铁屎米酮型或卡波啉型，具有较强的抗菌活性。许多研究表明铁屎米-6-酮生物碱是很有潜力的抗真菌成分，在较低的质量浓度(5~80 µg·mL-1)下就能表现出抗真菌活性，此外，生物碱还具有抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫、抗溃疡等生物活性，近年来逐渐成为臭椿研究的重点[2-3]。
目前，国内外对于臭椿生物碱的研究多侧重于结构鉴定和药理学方面[4-8]，而工业化提取方面研究较少。相对于其他植物，椿皮中的生物碱类化合物含量相对较低，传统的溶剂浸提方法存在操作时间长、溶剂用量大、提取率低等缺点。超声波辅助提取是近年来发展的一项新的提取技术，普遍应用于提取植物中的生物活性成分，具有提取时间短、产率高、避免有效成分被破坏等优点[9-12]，但超声技术应用于提取椿皮中生物碱的研究尚未见报道。本实验以椿皮为原料，乙醇为提取溶剂，以铁屎米-6-酮生物碱提取量为评价指标，在单因素试验基础上，采用中心组合试验设计和响应面分析法优选椿皮中铁屎米-6-酮生物碱的超声提取工艺，为椿皮药材的进一步开发利用提供参考。
Autobalance AD6000型超微量天平(PerkinElmer公司)；FL2200Ⅱ型高效液相色谱仪(浙江福立分析仪器股份有限公司)；SB-5200DNT型超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；RE-52A型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；GWA-UN5-30型超纯水器(北京普析通用仪器有限责任公司)；Eppendorf微量移液器。
椿皮药材样品购自安徽亳州药材市场，经赤峰学院植物学刘铁志教授鉴定为苦木科植物臭椿的干燥茎皮。铁屎米-6-酮对照品(陕西宝鸡市辰光生物有限公司，批号：20170312，HPLC>98%)；甲醇(天津市康科德科技有限公司，色谱纯)；乙腈(天津市康科德科技有限公司，色谱纯)；冰醋酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯)；95%乙醇(天津市恒兴化学试剂制造有限公司，分析纯)；水为超纯水(自制，并经0.22 μm水系滤膜过滤)。
Ultimate AQ-C18色谱柱(250 mm×4. 6 mm，5 µm)；流动相：乙腈-0.1%醋酸水溶液(35∶65)；流速：1.0 mL·min-1；紫外检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 µL。见图1。
图1 椿皮高效液相色谱图
A-对照品；B-供试品；1-铁屎米-6-酮。
Fig. 1 HPLC chromatograms
A-canthin-6-one control; B-sample; 1-canthin-6-one.
精密称取铁屎米-6-酮0.657 8 mg，以甲醇定容制成对照品溶液，精密吸取一定量对照品溶液，以甲醇配制成1.10，2.19，4.39，6.58，8.77，10.96，13.16，15.35 μg·mL-1的系列浓度，按“2.1”项下色谱条件进样，以峰面积Y与进样浓度X进行回归分析，得方程Y=10 026.52+70 252.688X(r= 0.999 4)，线性范围为1.10~15.35 μg·mL-1。
准确称取一定量的过80目筛的椿皮粉末置于锥形瓶中，在不同的超声条件下提取，提取液抽滤，滤液减压浓缩后定容，用0.22 μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。
2.4.1 液固比 称取椿皮粉末5份，每份3.000 g，固定乙醇浓度95%，超声时间20 min，超声温度30 ℃，分别用10，20，30，40，50mL·g-1的乙醇溶液提取，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样。铁屎米-6-酮生物碱提取量分别为10.26，12.08，15.22，14.28，14.13 µg·g-1，根据测定结果，选择液固比20~40 mL·g-1。
2.4.2 超声时间 称取椿皮粉末5份，每份3.000 g，固定乙醇浓度95%，液固比10 mL·g-1，超声温度30 ℃，分别提取20，30，40，50，60 min，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样。铁屎米-6-酮生物碱提取量分别为10.71，11.25，13.58，13.77，13.87 µg·g-1，根据测定结果，选择提取时间30~50 min。
2.4.3 超声温度 称取椿皮粉末5份，每份3.000 g，固定乙醇浓度95%，液固比10 mL·g-1，超声时间20 min，超声温度分别为0，30，40，50，60 ℃，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样。铁屎米-6-酮生物碱提取量分别为6.17，10.09，15.00，20.65，21.67 µg·g-1，根据测定结果，选择提取温度40~60 ℃。
2.4.4 乙醇浓度 称取椿皮粉末5份，每份3.000 g，固定液固比10 mL·g-1，超声时间20 min，超声温度30 ℃，分别用55%，65%，75%，85%，95%的乙醇溶液提取，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样。铁屎米-6-酮生物碱提取量分别为14.72，19.37，16.54，14.79，9.41 µg·g-1，根据测定结果，选择乙醇浓度55%~75%。
根据单因素试验，采用Design-Expert 8.0.6.1软件进行中心组合试验设计，以乙醇浓度、液固比、超声温度、超声时间为自变量，铁屎米-6-酮生物碱提取量为响应值，优化超声波辅助提取椿皮中铁屎米-6-酮生物碱工艺。试验因素水平见表1，试验安排及结果见表2。
表1 试验因素水平设计表
Tab. 1 Factors and levels of response surface test
表2 中心组合试验安排及结果
Tab. 2 Central composite design and results
应用Design-Expert 8.0.6.1软件对表2中数据进行多元回归分析，得回归方程Y=26.03+0.13A+ 0.25B+0.31C+0.27D+0.026AB+0.22AC+0.097AD+ 0.30BC+0.080BD+0.16CD+0.22A2+0.56B2+0.38C2+0.44D2。
对建立的模型进行方差分析，结果见表3。由方差分析可知，一次项中的B，C，D，交叉项AC，BC及各因素二次项对响应值的影响极显著，A，CD项对响应值的影响显著，AB，AD，BD项对响应值的影响不显著，说明响应值与自变量之间不是简单的线性关系。在本试验范围内，该模型的决定系数R2为0.959 0，校正后的决定系数0.920 7，模型极显著，失拟项不显著，说明回归方程拟合度良好，能较好地描述试验结果。
表3 响应面模型的方差分析
Tab. 3 Anova for response surface quadratic model
根据回归方程作响应面和等高线，考察各因素对铁屎米-6-酮生物碱提取量的影响。通过观察响应曲面的倾斜度和等高线形状密度，判断两者交互作用的显著性。响应曲面的坡度陡峭，表明形成该曲面的因素对响应值影响显著且存在较强交互作用；等高线密集成椭圆形，表明两因素对响应值影响显著且存在较强交互作用[13-14]。结果见图2~4。从图中可以看出AC，BC，CD项形成的曲面较陡峭，且等高线呈椭圆形，说明AC，BC，CD项交互作用较显著，对铁屎米-6-酮生物碱提取量影响显著。
图2 乙醇浓度与超声温度对铁屎米-6-酮提取量的响应面及等高线
Fig. 2 Response surface and contour plots of ethanol concentration and temperature on the extraction rate ofcanthin-6-one
图3 液固比与超声温度对铁屎米-6-酮提取量的响应面及等高线
Fig. 3 Response surface and contour plots of material-to- liquid and temperature on the extraction rate ofcanthin-6-one
图4 超声温度与超声时间对铁屎米-6-酮提取量的响应面及等高线
Fig. 4 Response surface and contour plots of extraction temperature and timeon the extraction rate ofcanthin-6-one
利用Design-Expert 8.0.6.1软件对回归方程进行分析，获得最佳提取工艺条件为乙醇浓度68.28%，液固比32.21mL·g-1，超声温度54.21 ℃，超声时间38.23 min，铁屎米-6-酮生物碱提取量为26.31 µg·g-1。考虑实际操作，将工艺条件修正为乙醇浓度68%，液固比32mL·g-1，超声温度54 ℃，超声时间38 min，按该工艺进行验证试验，结果铁屎米-6-酮生物碱提取量为26.19 µg·g-1(RSD=2.3%)，与模型预测值较为接近，表明建立的模型可靠，具有较好的预测性。
相对于其他植物，椿皮中的生物碱类化合物含量相对较低，采用超声波辅助提取，可节省时间，提高效率，并且工艺简单，适合大批量生产。通过响应面法优化超声辅助提取椿皮生物碱工艺，具有精确度高，模型预测性好的特点，得到了最佳工艺参数，对臭椿植物资源的进一步开发利用具有重要的参考价值。
本试验只考察了同一批次椿皮药材的提取工艺优化，由于药材的产地、采收时节、生长环境、存储加工等因素，椿皮中铁屎米-6-酮生物碱的含量可能存在较大的变化，这些因素与椿皮铁屎米-6-酮生物碱含量之间的关系，还需要进一步的研究。
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(本文责编：曹粤锋)
Optimization of Ultrasound-assisted Extraction Technology of Canthin-6-one from Bark ofAilanthus altissimaby Response Surface Methodology
LI Yongchun1,2, LI Xiaolan2, ZHAO Meirong2, ZHAO Yan2, ZHANG Zhi1*
(1.College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China; 2.College of Life Science, Chifeng University, Chifeng 024000, China)
ABSTRACT: OBJECTIVETo optimize ultrasonic-assisted extraction technology of canthin-6-one from bark ofAilanthus altissima.METHODSWith yield of canthin-6-one as index, extraction technology parameters were optimized by central composite design-response surface methodology on the basis of the single factor investigation of conditions for extracting canthin-6-one by ethanol.RESULTSOptimum extraction conditions were as follows: ethanol concentration 68%, liquid-solid ratio 32 mL·g-1, ultrasound temperature 54 ℃, extraction time 38 min. under these conditions, yield of canthin-6-one was 26.19 µg·g-1, which was close to the predicted value(26.31 µg·g-1).CONCLUSIONThis optimized technology is reasonable and reliable to provide a basis for development and application ofAilanthus altissima.
KEY WORDS:bark ofAilanthus altissima; canthin-6-one; ultrasound-assisted extraction; response surface methodology
中图分类号：R284.1
文献标志码：A
文章编号：1007-7693(2018)05-0628-05
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.05.002
引用本文：李永春, 李晓兰, 赵美荣, 等. 响应面法优化椿皮中铁屎米-6-酮生物碱超声辅助提取工艺[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(5): 628-632.
收稿日期：2017-10-30
基金项目：国家自然科学基金项目(31400459)
作者简介：李永春，男，博士生，讲师 Tel: 15047627886 E-mail: yongchun008@qq.com
*通信作者：张智，女，博导，教授 Tel：(0451)82190222 E-mail: ldzhangzhi@163.com