图1 高效液相色谱图
A-混合对照品溶液；B-果实供试品溶液；C-叶供试品溶液；D-花供试品溶液；1-芦丁；2-山奈酚-3-O-芸香糖苷。
Fig. 1 HPLC chromatograms
迪里木拉提·毛里明1，郭玉娟1，程煜凤1，任丽君2，姚军1*
(1.新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011；2.新疆昌吉职业技术学院，新疆 昌吉 831100)
摘要：目的 测定采集于新疆阿勒泰地区的10批次阿尔泰锦鸡儿根、茎、叶、花与果实药材中芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量。方法 色谱条件：Inertsil ODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，检测波长254 nm，流速1.0 mL·min-1，进样量5 μL，柱温25 ℃，流动相为0.2%磷酸(A)-乙腈(B)，线性梯度洗脱(0~5 min，10%→14%B；5~10 min，14%→17% B；10~16 min，17%→20% B；16~21 min，20%→22% B；21~30 min，22%→25% B；30~40 min，25% B)。结果 10批次阿尔泰锦鸡儿叶、花与果实药材中芦丁的平均含量为：果实6.83 mg·g-1，叶6.16 mg·g-1，花3.58 mg·g-1；山奈酚-3-O-芸香糖苷的平均含量为：果实1.48 mg·g-1，叶2.44 mg·g-1，花1.01 mg·g-1。根与茎供试品溶液中均未检测到这2种黄酮苷成分。结论 建立的方法简便、稳定性、重复性良好，为阿尔泰锦鸡儿药材黄酮类成分的研究提供了实验基础，亦为建立该药材的质量标准提供了重要的实验数据。
关键词：阿尔泰锦鸡儿；不同药用部位；黄酮苷；芦丁；山奈酚-3-O-芸香糖苷；含量测定
阿尔泰锦鸡儿(Caragana altaica kom. pojark)为豆科(Leguminosae)锦鸡儿属(Caragana Fabr)植物，分布于新疆阿勒泰地区布尔津县、富蕴县、福海县、哈巴河县、青河县等地[1-2]，花期2~3个月，其花称为金雀花，又称金孔雀。锦鸡儿属植物除具有保持水土、防风固沙、绿化荒山、改善环境的作用[3]，还具有良好的药用价值。阿尔泰锦鸡儿为一种哈萨克民间药材，其根、茎、叶、花与果实均可入药，主要用于治疗高血压[4]。在化学成分上，锦鸡儿属植物富含黄酮类、二苯乙烯类、苯丙素类、甾体及萜类化合物[5-7]。
黄酮类化合物为植物药中重要的降压活性组分之一[8-12]，其种类和含量与降压效果具有一定的相关性。课题组对阿尔泰锦鸡儿的前期研究[13-14]中，将阿尔泰锦鸡儿花醇提物经酸水解处理，发现了其中槲皮素、山奈酚和异鼠李素等3种黄酮苷元。然而，植物中黄酮类化合物主要以黄酮苷的形式存在。因此，本研究测定阿尔泰锦鸡儿不同药用部位主要黄酮苷类化合物的含量，为该药材的开发和利用提供实验基础。
Agilent 1220型高效液相色谱仪，DAD检测器，二元泵，Agilent OpenLAB工作站(美国Agilent公司)； Inertsil ODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(日本岛津公司)；AB135-S电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；HH-S4数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)。
乙腈(色谱纯，美国Fisher Scientific公司)；95%乙醇(分析纯，安徽安特生物化学有限公司)；磷酸(色谱纯，成都市新都区木兰镇工业开发区)；超纯水(新疆医科大学中心实验室)；芦丁对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：Y19N7S25244；纯度≥98%)；山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：66PF-WRMR；纯度≥98%)。
10批次阿尔泰锦鸡儿花药材于2016年5月采集于新疆阿勒泰地区。10批次阿尔泰锦鸡儿根、茎、叶与果实药材于2016年7月分别采集于和10批次花药材相对应的地点。药材均由新疆医科大学药学院帕丽达·阿不力孜教授鉴定为豆科(Leguminosae)锦鸡儿属(Caragana Fabr)植物阿尔泰锦鸡儿(Caragana altaica kom. pojark)的全草。
Inertsil ODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为0.2%磷酸(A)-乙腈(B)[15]；线性梯度洗脱(0~5 min，10%→14% B；5~10 min，14%→17% B；10~16 min，17%→20% B；16~ 21 min，20%→22% B；21~30 min，22%→25% B；30~40 min，25% B)；流速1.0 mL·min-1；进样量5 μL；柱温25 ℃；检测波长254 nm。
2.2.1 混合对照品溶液 精密称取芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品6.55和2.07 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷质量浓度分别为655和207 μg·mL-1的混合对照品溶液，备用。
2.2.2 阿尔泰锦鸡儿根、茎、叶、花与果实的供试品溶液 分别称取阿尔泰锦鸡儿根、茎、叶、花与果实药材各10 g，粉碎，过60目筛，称取药材粉末各0.5 g，分别置于100 mL 圆底烧瓶中加入50 mL 体积分数75%乙醇，80 ℃下加热回流提取1.5 h，过滤，药渣再次加入50 mL体积分数75%乙醇，同法提取1.5 h。合并2次滤液，减压浓缩至浸膏，将浸膏转移至25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得。
2.2.3 测定 按“2.1”项下色谱条件分别测定混合对照品溶液和阿尔泰锦鸡儿根、茎、叶、花与果实供试品溶液，色谱图见图1。
图1 高效液相色谱图
A-混合对照品溶液；B-果实供试品溶液；C-叶供试品溶液；D-花供试品溶液；1-芦丁；2-山奈酚-3-O-芸香糖苷。
Fig. 1 HPLC chromatograms
A-mixed reference samplesolution; B-fruit samplesolution; C-leaf sample solution; D-flower sample solution; 1-rutin; 2-kaempferol-3-O-rutinoside.
取“2.2.1”项下方法配制的芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷混合对照品溶液，用甲醇逐级稀释，在“2.1”项下色谱条件测定，以基线噪声的10倍(S/N≈10)作为定量限，以基线噪声的3倍(S/N≈3)作为检测限。结果，芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷的定量限分别为1.98 ng·mL-1(n=3，RSD=2.61)和2.86 ng·mL-1(n=3，RSD=1.75)，检测限分别为0.59和0.86 ng·mL-1。
分别吸取“2.2”项下制备的混合对照品溶液4，2，1，0.5 mL，分别加入10 mL量瓶中，用甲醇定容即得芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷质量浓度分别为262和82.8 μg·mL-1，131和41.4 μg·mL-1，65.5和20.7 μg·mL-1，32.75和10.35 μg·mL-1的系列浓度混合对照品溶液，将各系列浓度混合对照品溶液在“2.1”项下色谱条件测定，以峰面积(Y)对浓度(X)进行线性回归，得芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷的回归方程、回归系数(r)和线性范围。结果，芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷分别在32.75~ 655 μg·mL-1与10.35~207 μg·mL-1内线性良好，回归方程分别为Y=166 909.31X-1 229 107.82，r= 0.999 6和Y=123 738.13X-195 970.83，r=0.999 6。
取“2.4”项下芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷浓度分别为262和82.8 μg·mL-1的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷的峰面积。结果，芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷峰面积的RSD分别为0.94%和0.74%，表明仪器精密度良好。
取“2.2.2”项下制备的同一批阿尔泰锦鸡儿花供试品溶液1份，按“2.1”项下色谱条件分别于0，4，12，16，24 h后测定。结果，阿尔泰锦鸡儿花供试品溶液中芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷峰的面积RSD分别为4.85%和1.75%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
取同一批阿尔泰锦鸡儿花药材5份，按“2.2.2”项下方法制备花供试品溶液，于“2.1””项下色谱条件分别测定。结果，5份花供试品溶液中芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷的峰面积RSD分别为2.18%和2.56%，表明方法重复性良好。
取同一批已测知含量的阿尔泰锦鸡儿花药材9份，分别按低、中、高剂量加入相应量的芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备花供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定花供试品溶液中芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷的峰面积，代入回归方程计算芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量，计算回收率，见表1。
表1 芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷的加样回收率试验结果(n=3)
Tab. 1 Results of recovery test of rutin and kaempferol-3- O-rutinoside (n=3)
取编号为S1~S10的阿尔泰锦鸡儿根、茎、叶、花与果实药材各1份，“2.2.2”项下方法制备阿尔泰锦鸡儿根、茎、叶、花与果实的供试品溶液，每一份供试品溶液在“2.1”项下色谱条件连续测定3次，代入回归方程计算浓度，将计算结果换算成质量浓度[化合物质量(mg)/相应生药质量(g)]。结果，根与茎供试品溶液中均未检测到芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷，花、叶与果实供试品溶液中均含有这2中黄酮苷，见表2。
表2 10批次阿尔泰锦鸡儿药材中芦丁和山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量测定结果(n=3)
Tab. 2 Content determination results of rutin and kaempferol-3-O-rutinoside in 10 batches of Caragana altaica kom. pojark(n=3) mg·g-1
本研究考察了甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液等流动相系统。结果发现，以乙腈-0.2% 磷酸溶液为流动相系统时样品中各种成分分离较好，提供了丰富的色谱信息。因此确定乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相。
实验中，先在200~400 nm波长范围内对供试品溶液进行UV扫描，结果在254和360 nm波长处有较大吸收，360 nm处色谱峰数目较少，但丰度较高。260 nm处色谱峰数目较多且基线噪音较低，而丰度降低，分离度较好，基线稳定。考虑到各组分的检测信号强度与灵敏度，本实验选择波长为254 nm。
阿尔泰锦鸡儿不同药用部位中芦丁与山奈酚-3-O-芸香糖苷的含量具有显著差异。芦丁在果实和叶中含量最高并且含量差异不大，相当于花中含量的2~3倍。山奈酚-3-O-芸香糖苷在叶中含量较高，花和果实中的含量相差不大并均小于叶中含量。叶、花、果实中芦丁含量均大于山奈酚-3-O-芸香糖苷，预示着阿尔泰锦鸡儿叶、花、果实中黄酮类化合物较为丰富而在根、茎中相对较少。
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(本文责编：曹粤锋)
Study on content determination of main flavonoid glycosides in different medical parts of Caragana altaica kom. pojark
DILIMULATI Maoliming1, GUO Yujuan1, CHENG Yufeng1, REN Lijun2, YAO Jun1*
(1.College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China; 2.Xinjiang Changji Vocational and Technical College, Changji 831100, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To determine the content of rutin and kaempferol-3-O-rutinoside in the roots, stems, leaves, flowers and fruits of Caragana altaica kom. pojark from Xinjiang Altai Region. METHODS HPLC conditions: Inertsil ODS-3 column(250 mm×4.6 mm, 5 μm), detection wavelength at 254 nm, flow rate at 1.0 mL·min-1, injection volume was 5 μL and column temperature was 25 ℃. A gradient elution of 0.2% phosphoric acid (A) and acetonitrile (B) solution were performed with following procedure: 0-5 min, 10%→14% B; 5-10 min, 14%→17% B; 10-16 min, 17%→20% B; 16-21 min, 20%→22% B; 21-30 min, 22%→25% B; 30-40 min, 25% B. RESULTS The average content of rutin in 10 batches of fruits, leaves and flowers was 6.83, 6.16, 3.58mg·g-1 and the average content of kaempferol-3-O-rutinoside was 1.48, 2.44, 1.01 mg·g-1, respectively. However, neither rutin nor kaempferol-3-O-rutinoside were detected in the roots and stems of Caragana altaica kom. pojark. CONCLUSION The content determination method established in this study is simple and showes good stability and repeatability. Furthermore, this study provides experimental basis for the study of flavonoid glycosides in Caragana altaica kom. pojark. and provides essential experimental data for the establishment of quality standard of that plant.
KEY WORDS:Caragana altaica kom. pojark; different medical parts; flavonoid glycosides; rutin; kaempferol-3-O-rutinoside; content determination
中图分类号：R284.1；R971.101
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2018)05-0704-04
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.05.018
引用本文：迪里木拉提·毛里明, 郭玉娟, 程煜凤, 等. 阿尔泰锦鸡儿不同药用部位主要黄酮苷的含量测定[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(5): 704-707.
收稿日期：2017-09-09
基金项目：新疆地产中药民族药新药研发培育项目(2017-02-03)
作者简介：迪里木拉提·毛里明，男，硕士生 Tel: 13629940515 E-mail: 982663735@qq.com
*通信作者：姚军，男，教授，博导 Tel: 18999250641 E-mail: xydyaojun@163.com