裸花水竹草脂溶性成分及其抗氧化活性研究

(1.广西壮族自治区中医药研究院，南宁 530022；2.广西中药质量标准研究重点实验室，南宁 530022)

摘要：目的分析裸花水竹草的脂溶性成分及其抗氧化活性。方法利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对裸花水竹草药材的脂溶性成分进行分析和鉴定，并通过标准质谱谱库的计算机检索进行化学成分定性；采用清除DPPH自由基及ABTS自由基能力的方法对裸花水竹草的脂溶性成分进行抗氧化活性研究。结果从裸花水竹草的脂溶性成分中共鉴定出23个成分，同时抗氧化结果显示裸花水竹草的脂溶性成分对DPPH自由基及ABTS自由基的半数清除浓度IC50分别为5.255，3.848 mg·mL-1。结论裸花水竹草的脂溶性成分主要为不饱和脂肪酸类化合物及植醇，均为首次从该植物中鉴定出；其脂溶性成分具有一定的抗氧化活性。

关键词：裸花水竹草；脂溶性成分；气相色谱-质谱联用；抗氧化活性

壮药裸花水竹草来源于鸭跖草科水竹草属植物Murdannia nudiflora(Linn.) Brenan的全草，其味甘、淡，性凉，归肺、胃经，具有清肺热，凉血解毒的功效，主治肺热咳嗽、咳血，吐血，咽喉肿痛，目赤肿痛，外用则治疮痈肿痛[1]。随着PM 2.5颗粒对我国国民健康的影响日益严重，加强中草药对呼吸道疾病预防和治疗，特别是对肺结核、肺炎等疾病方面的应用具有重要的现实意义。根据《壮族民间用药选编》摘录[2]，裸花水竹草是一种可用于治疗肺结核的壮民族特色药物。通过查阅国内外相关文献，未见有关裸花水竹草脂溶性化学成分的研究报道，为了充分利用和开发其药用资源，对裸花水竹草脂溶性化学成分的研究显得极有必要。本研究利用气相色谱-质谱(GC-MS)联用技术对裸花水竹草药材的脂溶性成分进行分析和鉴定，并通过标准质谱谱库的计算机检索进行化学成分定性，同时采用清除DPPH自由基及ABTS自由基能力的方法对裸花水竹草的脂溶性成分进行抗氧化活性研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent Technologies，HP6890GC/5973MS)；UV2550紫外分光光度计(岛津)；RE-52旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；JJ500型电子天平(常熟市双杰电子仪器厂)；SHZ-D循环水式真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；V124126全波长酶标仪(Thermo Multiskan Go)。

1.2 材料

裸花水竹草药材采自广西南宁市郊，由广西中医药研究院何开家主任中药师鉴定为裸花水竹草Murdannia nudiflora(Linn.) Brenan。石油醚、乙酸乙酯、氢氧化钾、苯、无水乙醇均为分析纯，购自广东光华科技股份有限公司。2,2-二苯基-1-苦肼基(DPPH，麦克林公司，批号：D807297；纯度：98%)；2,2-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS，麦克林公司，批号：A800764；纯度：98%)。

2 方法

2.1 供试品溶液的制备

裸花水竹草药材，阴凉处风干，粉碎，称取11.0 kg，加95%乙醇加热回流提取，过滤，滤液浓缩至稠膏状，加水混悬，用石油醚(60~90 ℃)萃取，得到石油醚萃取液，浓缩后得石油醚部位153 g。

取石油醚部位153 g，经硅胶层析柱分离，依次用石油醚-乙酸乙酯(100∶0→98∶2→95∶5 →90∶10 →80∶20→ 70∶30)梯度洗脱，收集得到279个流份，每份500 mL，第1~6流份为半固体油状物，合并备用。

取上述备用的半固体油状物110 mg，进行甲基化[2]：将样品置于100 mL具塞烧瓶中，加石油醚(60~90 ℃)-苯(1∶1，体积比)20 mL使其溶解，并加入0.4 mol·L-1KOH-MeOH溶液10 mL，摇匀，于50 ℃恒温水浴30 min，停止加热，加入纯净水20 mL，振摇，静置分层，取上清液，上清液加入无水硫酸钠脱水后过滤，滤液作为GC-MS分析试样。

2.2 GC-MS条件

GC条件：HP-5MS石英毛细管柱(30 mm×0.25 mm×0.25mm)；柱温：起始温度为80 ℃，程序升温，以5 ℃·min-1至260 ℃，保持30 min；柱流量为1.0 mL·min-1；进样口温度250 ℃；柱前压100 kPa；进样量1.0mL；分流比50∶1；载气为高纯氦气。

MS条件：电离方式EI；电子能量70 eV；传输线温度250 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；质量范围35~500；色谱峰面积归一化法计算各主要成分的相对含量。采用NIST11标准质谱谱库计算机检索定性。

2.3 DPPH抗氧化方法

采用清除DPPH自由基的方法测定脂溶性成分的抗氧化能力[3-6]：称取25.675 mg的DPPH，使用无水乙醇溶解，定容于100 mL量瓶，得到6.5×10-4mol·L-1的DPPH乙醇溶液，备用，使用时稀释10倍，即浓度为6.5×10-5mol·L-1；样品浓度设置为6个梯度：6.0，5.0，4.0，3.0，2.0，1.0 mg·mL-1，每个浓度使用1 cm比色皿在517 nm波长处平行测试3次吸光度，取其平均值；计算样品对DPPH的清除率。

其中：A0为加入10 mL 6.5×10-5mol·L-1DPPH和2 mL的试样溶剂(无水乙醇︰乙酸乙酯= 1︰1)混匀后测定的吸光度值；Ai为10 mL 6.5×10-5mol·L-1DPPH和2 mL的试样混匀后测定的吸光度值；Aj为10 mL无水乙醇和2 mL的试样混匀后测定的吸光度值。

以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图，使用回归分析方法求出清除率为50%时样品的浓度(IC50)，使用半数清除浓度(IC50)来表示样品的抗氧化活性结果。

2.4 ABTS抗氧化方法[7-8]

将3 mL的7 mmol·L-1ABTS和3 mL的2.45 mmol·L-1过硫酸钾溶液混合，在室温避光条件下静止过夜，形成ABTS+自由基储备液。使用前加70%乙醇调至吸光度为0.700±0.005，在96孔板中每孔加入40 μL的样品，样品设置5个浓度，10.0，8.0，6.0，4.0，2.0 mg·mL-1再加入160 μL ABTS+自由基工作液，振荡充分混合后，以200 μL 70%乙醇为空白，静置6 min，在734 nm波长下测定吸光度。

其中：A0为加入160 μL ABTS+和40 μL试样溶剂混匀后测定的吸光度值；Ai为160 μL ABTS+和40 μL试样混匀后测定的吸光度值；Aj为160 μL ABTS+溶剂和的40 μL试样混匀后测定的吸光度值。以样品浓度为横坐标，清除率为纵坐标作图。

3 结果与分析

3.1 裸花水竹草脂溶性成分GC-MS的分析结果

经GC-MS检测，得到样品的总离子流图，见图1。根据总离子流图的结果分析可知，各组分经NIST11标准质谱谱库计算机检索和比对，并按面积归一化法计算出各组分的相对百分含量，结果见表1。结果表明，裸花水竹草的脂溶性成分主要为不饱和脂肪酸类化合物及植醇，含量较高的成分分别为十八碳二烯酸(17.10%)、十八碳烯酸(16.09%)、植醇(19.85%)。

Tab. 1 Analysis of liposoluble constituents fromMurdannianudiflora(Linn.) Brenan

width=198.8,height=113.9

图1 样品的总离子流程图

Fig. 1 Total ion carrent of the sample

3.2 抗氧化活性的测定结果

清除DPPH自由基能力的试验结果显示，裸花水竹草的脂溶性成分具有一定的抗氧化活性。在测定的浓度范围内，抗氧化活性随着试样浓度的增加而逐渐增强，呈现良好的剂量依赖性，见图2。使用回归分析方法得到回归方程y=8.107x+7.392(R2=0.999 3)，计算得到IC50值为5.255 mg·mL-1。

清除ABTS+自由基能力的试验结果显示，在测定的浓度范围内，抗氧化活性随着试样浓度的增加而逐渐增强，呈现良好的剂量依赖性，结果见图3。使用回归分析方法得到回归方程：y=3.648x+35.961(R2= 0.999 3)，计算得到IC50值为3.848 mg·mL-1。

4 结论

通过使用GC-MS联用技术对裸花水竹草脂溶性成分进行检测分析，共检出42个组分，并鉴定了23个成分。从分析结果可知，分离得到的脂溶性成分主要为不饱和脂肪酸类化合物及植醇，其中十八碳二烯酸、十八碳烯酸和植醇的含量分别为17.10%，16.09%和19.85%。同时从抗氧化结果显示裸花水竹草的脂溶性成分具有一定的抗氧化活性，可能是其中的十八碳二烯酸即亚油酸，以及十八碳烯酸等不饱和脂肪酸中的不饱和键表现出一定的抗氧化能力。同时十八碳二烯酸属于多不饱和脂肪酸，临床实验发现，多不饱和脂肪酸具有抗炎症、抗肿瘤、调节血脂、提高免疫力、预防心血管疾病及治疗精神分裂症等多种生理功能[9]，因此对本药物的抗肺炎方面的功效具有较高的开发利用价值。本研究为裸花水竹草药用价值的进一步开发和利用提供了科学依据。

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Study on the Components and Antioxidant Activites of the Liposoluble ConstituentsfromMurdannia Nudiflora(Linn.) Brenan

HUANG Zhoufeng1, LU Wenjie1,2*, TAN Xiao1, LU Guoshou1, HUANG Jianyou1, HU Xiaoxi1

(1.Guangxi Institute of Chinese Medicine & Pharmaceutical Science, Nanning 530022, China; 2.Guangxi Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Stardands, Nanning 530022, China)

ABSTRACT: OBJECTIVETo analyze the components and antioxidant activites of the liposoluble constituents fromMurdannia nudiflora(Linn.) Brenan.METHODSThe liposoluble constituents fromMurdannia nudiflora(Linn.) Brenan were analyzed by GC-MS and identified by the searching of standard mass spectral library on computer. The antioxidant activites were detected by DPPH free radical and ABTS free radical scavenging method.RESULTSThe 23 compounds were identified fromMurdannia nudiflora(Linn.), and the half elimination ratio (IC50) of scavenging activity of free radical in DPPH and ABTS were 5.255, 3.848 mg·mL-1, respectively.CONCLUSIONThe bioassay indicated that the liposoluble constituents fromMurdannia nudiflora(Linn.) Brenan possessed antioxidant activites. Unsaturated fatty acid and phytol are major chemical constituents of these components. All the compounds were identified from this plant for the first time. The liposoluble constituents fromMurdannia nudiflora(Linn.) Brenan possessed antioxidant activites.

KEY WORDS:Murdannia nudiflora(Linn.) Brenan; the liposoluble constituents; GC-MS; the antioxidant activites

引用本文：黄周锋, 卢文杰, 谭晓, 等. 裸花水竹草脂溶性成分及其抗氧化活性研究[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(5): 674-677.

基金项目：广西中药质量标准研究重点实验室系统性研究课题(桂中重系201309)

作者简介：黄周锋，男，硕士，助理研究员 Tel: (0771)5868986 E-mail: ferhung@126.com

*通信作者：卢文杰，男，主任药师 Tel: (0771)5868986 E-mail: luwenjie0771@163.com