神经毒素(neurotoxin，NT)是一种从中华眼镜蛇(naja naja atra)毒液中分离得到的水溶性碱性多肽[1]，主要通过与中枢中脑导水管周围灰质(periaqueductal gray，PAG)的胆碱能受体结合产生镇痛功效，其效价强度比吗啡高数十倍，且无耐受性和成瘾性[2]，是一种新型的替代性镇痛药物，现已有肌肉注射剂上市，商品名为科博肽注射液[3]。但 NT肌肉注射不易透过血脑屏障(brain blood barrier，BBB)，起效较慢，因此无法充分发挥其镇痛作用。
介孔二氧化硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles，MSN)作为一种新型的无机介孔材料，具有载药量大、易于修饰或改性、生物相容性良好等优点，在新型给药载体领域中具有广阔的研究前景[4-6]。已有相关研究表明，MSN对多肽类药物的负载是可行有效的[7-9]。但是，MSN存在团聚严重、靶向能力差、载药易突释等缺陷，极大阻碍了其应用和发展，有研究表明脂质囊包裹后的介孔二氧化硅纳米粒(LP-MSN)不仅可以降低突释，还可以降低其在溶液中的团聚，在生理环境中减少其与蛋白质的非特异性结合，提高稳定性[10-11]。同时在 LP-MSN表面修饰配体可以达到将治疗药物向特定部位递送的效果。
低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein，LRP)是脑毛细血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells，BMEC)上存在的特异性受体，不存在内源性竞争抑制，且无免疫原性，介导效率较高。Angiopep-2(ANG)为LRP受体人工合成的配体，在跨越BBB的过程中，其转运效率和透过性相对较高，且其在跨膜转运过程中不受 P-糖蛋白外排作用的影响，已广泛用于脑内递药领域，并取得了良好效果[12-13]。
本实验制备了ANG修饰的介孔二氧化硅脂质囊纳米粒(ANG-LP-MSN)，用于运载镇痛药物NT，通过表征、考察其体外释放特性及体内镇痛作用，为多肽类药物脑内递药提供参考。
1 仪器与试剂
Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；Nano-ZS 90激光粒度分析仪(英国Malvern仪器有限公司)；HT7700透射电子显微镜(日本日立公司)；TRISTAR II3020全自动比表面和孔隙分析仪(美国 Micromeritics仪器公司)；Rigaku D-max 2550PC全自动多晶 X射线衍射仪(日本理学电机株式会社)；Optima Max超速低温离心机(美国Beckman Coulter有限公司)；马弗炉(SX3-1.5-10，杭州卓驰仪器有限公司)。
NT(云南龙凤谷生物药业有限公司，批号：H45021228)；异硫氰酸荧光素(FITC，美国Sigma-Aldrich公司，批号：BCBQ3411V)；FITC单标记的神经毒素(FITC-NT，纯度＞99%，自制)；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，批号：BCBS5500V)和正硅酸乙酯(TEOS，上海阿拉丁试剂有限公司，批号：BCBP0911V)；Angiopep-2偶联二硬脂酰磷脂酰聚乙二醇(DSPE-PEG-ANG，杭州中肽生化有限公司，批号：CM-10-01188)；二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC，批号：B51276)、二硬脂酰磷脂酰聚乙二醇(DSPE-PEG，批号：B50845)和胆固醇(批号：B40333)均购于上海艾韦特医药科技有限公司)；其他试剂均为分析纯。
清洁级ICR小鼠，♀，体质量(20±2)g，由浙江中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(沪)2014-0001。本实验所涉及的动物均按照浙江中医药大学动物饲养规则和使用指南进行。
2 方法与结果
2.1 MSN的制备
在 Stober法的基础上，改进制备工艺，将1.75 mL的2 µmol·L-1NaOH溶液加入到 240 mL去离子水中，80 ℃搅拌均匀后，加入0.5 g CTAB，搅拌30 min，快速加入5.0 mL TEOS，继续剧烈搅拌2 h，静置熟化6 h，在100 ℃下干燥12 h。将干燥MSN粉末转入坩埚，在马弗炉中煅烧，即得不含模板剂的MSN。
2.2 浸渍吸附法制备MSN-NT
FITC-NT的合成纯化方法如笔者前期研究所述[14]。将 FITC-NT溶解于去离子水中，制成0.5 mg⋅mL-1的溶液，加入MSN 5 mg，超声处理，以保证分散均匀，然后将混合溶液在转速为300 r⋅min-1下搅拌 24 h，离心(7 000 r⋅min-1)30 min，所得沉淀减压干燥得MSN-NT。
2.3 ANG-LP-MSN-NT的制备
称取DSPC 35 mg、胆固醇10 mg、DSPE-PEGANG 5 mg置于茄形瓶，加入少量三氯甲烷，超声溶解，45 ℃下旋蒸至完全干燥，将10 mg MSN-NT分散至5 mL乙醇，用注射器沿四周注入到茄形瓶，40 ℃下旋转蒸发成膜。然后用PBS(pH 7.4)溶液水化超声得到混悬液，经葡聚糖凝胶柱(G-100)分离空白脂质囊后得到 ANG-LP-MSN-NT。除不加入DSPE-PEG-ANG脂质材料，LP-MSN-NT同法制备。
2.4 ANG-LP-MSN-NT的表征
2.4.1 粒径、电位及形态 采用Nano-ZS 90激光粒度分析仪测定各纳米粒的粒径、多分散指数(PDI)及 Zeta电位，结果显示 MSN粒径为(115.20±3.32)nm(PDI=0.05±0.02)，Zeta 电位为(-40.10±2.11)mV，包裹脂质囊和连接 ANG之后，纳米粒的粒径和Zeta电位有所增大，结果见表1。
采用 HT7700透射电子显微镜观察 MSN和ANG-LP-MSN-NT的形态，结果见图1。结果显示在透射电子显微镜下，MSN和ANG-LP-MSN-NT形态规整，呈圆整球形，分散性良好，无团聚现象，ANG-LP-MSN-NT外周出现灰亮色的光圈证实脂质囊包裹成功。
表1 纳米粒的主要表征参数(
)
Tab. 1 Main characterization paramters of particles()
图1 纳米粒透射电镜图
Fig. 1 The TEM images of nanoparticles
2.4.2 小角度粉末衍射 采用 X-射线衍射仪观察粒子的小角度粉末衍射行为，扫描区间为 0.5°～10°，扫描速度为 1°⋅min-1，电压为 40 kV，电流为200 mA，见图2，在2°～3°之间出现1个明显的衍射峰，表明制得的MSN具有有序的介孔结构。
图2 MSN的小角度粉末衍射曲线
Fig. 2 Small angle X-ray diffraction pattern of MSN
2.4.3 氮气吸-脱附 通过氮气吸-脱附等温线分析MSN的比表面积和平均孔径，结果见图3。根据IUPAC分型，MSN的吸-脱附等温曲线明显符合IV型分布，表明MSN有均一的介孔结构。通过计算可得出 MSN的比表面积为557 m2⋅g-1，孔容积(Vp)为 0.58 cm3⋅g-1，孔径为 2.94 nm。
2.4.4 包封率(EE)和载药量(DL) 精密称取ANG-LP-MSN-NT纳米粒至离心管中，低温超速离心 45 min (4 ℃，25 000 r·min-1)后取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液用HPLC测定，计算上清液中游离的FITC-NT含量，记作W1；按以下公式分别计算ANG-LP-MSN-NT的包封率和载药量。
注：W0为 FITC-NT总投药量；W1为ANG-LP-MSN-NT中的游离药物量；Wt为ANG-LP-MSN-NT的总质量。
测得 ANG-LP-MSN-NT的包封率为(91.82±3.12)%，载药量为(10.75±0.54)%。
图3 MSN的N2吸-脱附等温线(A)和孔径分布图(B)
Fig. 3 N2adsorption-desorption isotherms (A) and poresize distribution (B) of MSN
2.4.5 体外释药特性 采用透析袋法测定ANG-LP-MSN-NT的体外释药特性，释放介质为PBS溶液(pH 7.4)。精密称取FITC-NT、MSN-NT、LP-MSN-NT和 ANG-LP-MSN-NT适量(含FITC-NT 1 mg)，分别置于透析袋中，密封后分别放入装有500 mL PBS的烧杯中，然后置于37 ℃、100 r⋅min-1恒温水浴震荡器中，平行操作3份。于0.25，0.5，0.75，1，2，4，6，8，12，24，48 h时间点吸取0.5 mL的透析液，并补充同温等量释放介质。样品用0.22 μm微孔滤膜过滤后，续滤液经HPLC测定FITC-NT浓度，计算累积释放率，结果见图4。MSN-NT、LP-MSN-NT和ANG-LPMSN-NT与FITC-NT溶液相比，均呈现明显的缓释特性。FITC-NT溶液释药迅速，8 h内的释药量达 98%，已基本释放完全，而 ANG-LP-MSN-NT在24 h内NT的累积释放量为70.3%，48 h的累积释放量达到75.7%。LP-MSN-NT和ANG-LP-MSNNT释药特性相似。但MSN-NT在初始4 h内突释现象较为明显，累积释药量达到 53.6%，而ANG-LP-MSN-NT和 LP-MSN-NT经脂质囊的包裹突释有所降低，说明脂质囊包裹的MSN具有防突释特性。
图4 FITC-NT、MSN-NT、LP-MSN-NT、ANG-LP-MSN-NT体外释药曲线(n=3)
Fig. 4 The in vitro release curves of FITC-NT, MSN-NT,LP-MSN-NT, ANG-LP-MSN-NT(n=3)
2.5 药效学研究
2.5.1 热板法镇痛试验 以小鼠舔足或跃起时间为痛阈指标，温度(55±0.5)℃。给药前先测定基础痛阈，将基础痛阈不在l0～30 s内的小鼠剔除，设定60 s为持续加热的上限，以防动物组织损伤[15]。取 90只符合要求的小鼠，体质量(20±2)g，随机分成 6组，分别为生理盐水(NS)组、NT组、FITC-NT组、MSN-NT组、LP-MSN-NT组和ANG-LP-MSN-NT组。NT、FITC-NT、MSN-NT、LP-MSN-NT和 ANG-LP-MSN-NT组分别均给予NT 100 μg⋅kg-1，NS 组注射等量生理盐水。测定小鼠给药后30，60，90，120 min的痛阈值变化。结果见图5。
由图5可知，NT组和FITC-NT组的痛阈值几乎保持一致；给药前各组的痛阈值相似；给药60 min后，ANG-LP-MSN-NT组与其他组相比，痛阈显著提高，起效时间缩短，作用时间延长，且镇痛效果明显；LP-MSN-NT组痛阈虽有所提高，但相比于 ANG-LP-MSN-NT组并不显著；MSNNT组有延长作用时间的趋势，但效果不显著。
2.5.2 醋酸扭体法镇痛试验 取90只小鼠随机分成生理盐水(NS)组、NT组、FITC-NT组、MSN-NT组、LP-MSN-NT组和ANG-LP-MSN-NT组6组。NT、FITC-NT、MSN-NT、LP-MSN-NT 和 ANG-LPMSN-NT 组分别均给予 NT 100 μg⋅kg-1，NS 组注射等量生理盐水。给药后 1 h每只小鼠按10 mL·kg-1剂量腹腔注射 0.6%醋酸，观察并记录30 min内小鼠的扭体次数[16]。结果见图6。
由图6可知，NT组和FITC-NT组的扭体次数基本保持一致；ANG-LP-MSN-NT组与其他组比较，小鼠扭体次数显著减少，说明ANG-LP-MSNNT能显著降低小鼠对化学刺激的敏感性，镇痛效果显著；与FITC-NT组比较，LP-MSN-NT组药效有所增强，扭体次数有所减少，但相比 ANG-LPMSN-NT组增效不显著。
图5 各组热板法镇痛试验结果与 FITC-NT 组比较，1)P＜0.05，2)P＜0.01。
Fig. 5 The analgesia results of hot plate test in each group
Compared with FITC-NT group,1)P＜0.01,2)P＜0.01.
图6 各组醋酸扭体法镇痛实验结果(n=15)与FITC-NT组比较，1)P＜0.01。
Fig. 6 The analgesia results of acetic acid writhing test in each group(n=15)Compared with FITC-NT group,1)P＜0.01.
3 讨论
本实验采用改进的 Stober法成功制备了ANG-LP-MSN-NT，并将粒径控制在130 nm以下，粒径较小，有助于其透过 BBB。在纳米粒制备过程中采用了煅烧法，而非采用乙醇萃取法去除模板剂，主要是因为弱酸性乙醇萃取会导致晶体结构不稳定，甚至坍塌，而通过煅烧处理可使得介孔孔壁更加紧实，提高材料的水热稳定性[17]。
NT为大分子多肽药物，本实验中MSN的多孔结构和巨大的比表面积可以吸附和运载 NT，MSN-NT具有较大的载药量，这主要是由于不同的机制的互相作用，如通过孔道表面大量硅羟基与药物之间的氢键作用、静电作用和疏水性相互作用、多肽分子表面氨基酸残基与二氧化硅表面的负电荷键合等[8-10]。
NT为水溶性多肽，为考察ANG-LP-MSN-NT体外释药特性，采用较常用的动态透析袋法，以pH 7.4 PBS缓冲液作为释放介质进行体外释放特性考察。从释药曲线可以发现，释药初期ANG-LPMSN-NT有轻微突释现象，但相比未经脂质囊包裹的MSN-NT明显减弱，ANG-LP-MSN-NT突释可能是由于MSN介孔外部存在少量的NT，这有利于药物能快速达到有效治疗浓度；而在释放后期，MSN介孔内部的NT缓慢进入释放介质中，有利于维持有效治疗浓度。药物在纳米粒内层的释放途径主要是释放介质渗透进入孔道导致药物溶解，然后药物经过溶剂扩散到释放介质中，释药速率仅与扩散到纳米粒表面的路径距离有关，因此释药速率稳定，此外，NT在MSN中的释放可能还依赖二氧化硅纳米粒的降解，已有研究显示二氧化硅纳米粒会随着时间在体内代谢，主要经过硅骨架的溶蚀降解和扩散过程，降解为游离硅离子后主要经肾脏滤过，由尿液排出[18]。
本次镇痛试验从中枢镇痛和外周镇痛全面考察经靶头修饰的ANG-LP-MSN-NT的镇痛作用。研究结果表明，经ANG修饰的纳米粒腹腔给药后镇痛效果显著高于未经ANG修饰的纳米粒。这提示ANG修饰后NT易透过BBB，从而发挥更好的镇痛药效。
综上所述，ANG-LP-MSN对于多肽类药物是一种优良的载体，MSN对NT有较高的载药量，脂质囊的包裹解决了MSN药物易突释的问题，而修饰的ANG能有效使药物透过BBB。因此ANG修饰的MSN有望成为无法通过BBB的中枢性药物的高效载体。
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