心肌缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury，IRI)是一种临床上常见的心血管疾病的致病因素，在溶栓治疗、冠状动脉支架植入、冠状动脉搭桥术等病理过程中常见[1]。心肌IRI出现后会引起缺氧复氧再损伤。IRI的另一个较为明显的病理特征是心肌细胞会发生氧化应激损伤，而过度的氧化应激和内质网应激会引起心肌细胞凋亡的发生[2]，因此，如何降低心肌细胞氧化应激和内质网应激所产生的损伤是科研领域研究的热点。酪氨酸蛋白激酶 2/信号转导子和激活3(JAK2/STAT3)为JAK/STAT家族中研究最多的信号传导通路[3]，并且有研究报道 IRI大鼠心肌中JAK2/STAT3信号通路被显著激活，严重诱发心肌细胞氧化应激损伤[4-5]。
萝卜硫素是一种异硫氰酸酯类家族药物，主要来源于十字花科植物。研究发现，萝卜硫素具有较为广泛的药理活性，如抗氧化活性及抗肿瘤功效[6]。近年来，研究发现萝卜硫素可以通过其抗氧化及抑制心肌细胞凋亡作用改善心肌损伤[7]，还可以通过减少心肌细胞凋亡及抑制脂质过氧化物产生对心肌IRI起保护作用[8]。因此，本实验在体外构建IRI的心肌细胞模型，研究萝卜硫素对新生大鼠心肌细胞IRI的保护效应，并对其作用机制进行初步研究。
1 材料及方法
1.1 动物
出生2～3 d的SD乳鼠，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(辽)2003-0007。
1.2 药品及试剂
萝卜硫素(上海原叶生物有限公司，含量≥99%，批号：121-42-3)；DMEM培养基(武汉谷歌生物科技有限公司，批号：12800017)；胎牛血清(Gibco公司，批号：MM-0703M2)；JAK2抑制剂(SAR302503，Sigma公司)；BCA 试剂盒(上海谷歌生物有限公司，批号：P0012S-54)；CCK8试剂盒(上海威奥生物科技有限公司)；LDH(批号：20160324)、MDA(批号：20160511)及 SOD 试剂盒(批号：20161102)均购自南京建成生物科技有限公司；β-actin、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3一抗均购自美国Sigma公司；二抗羊抗兔IgG购自美国Sigma公司。
1.3 仪器
BBS-V800单人超净台(苏州华新空调净化有限公司)；SANYO细胞培养箱(上海医用分析仪器厂)；Victor3 1420 Multilable Counter酶标仪(南京德铁仪器公司)；DYCZ-24DN型SDS-PAGE凝胶电泳(北京六一仪器厂)；双BIO-RAD色红外激光成像系统(美国Bio-Bad)。
1.4 乳鼠心肌细胞原代培养
在无菌条件下取出乳鼠的心尖部分，并将其剪为0.5～1 mm3大小的组织块，用0.08%胰蛋白酶在37 ℃恒温消化10 min，再吸弃上清，重复胰蛋白酶消化4～5次，每次约8 min，收集消化所得细胞，过筛网得到的单个细胞置于含 15%小牛血清的低糖DMEM培养基中，放入5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养1.5～2 h，差速贴壁法得到心肌细胞，接种于培养瓶置5% CO2、37 ℃培养箱中继续培养。
1.5 IRI细胞模型构建
体外培养新生大鼠心肌细胞于缺氧24 h复氧1 h构建IRI细胞模型，观察细胞损伤情况[8]。
1.6 CCK8试验
调整细胞密度为1×105·mL-1接种于96孔板，分别取正常条件下、缺血24 h和再灌注1 h后培养的心肌细胞及加入 3种不同浓度(10，20，40 μg·mL-1)萝卜硫素及 JAK2抑制剂后缺血和再灌注条件下培养的心肌细胞，每组设置6个复孔。然后弃去旧培养基，每孔加入10 μL CCK8试剂，在正常条件下培养1 h后置于酶标仪中于450 nm处测定吸光度OD值，并计算细胞相对存活率。
1.7 上清中LDH活力及细胞匀浆中MDA含量和SOD活力检测
调整细胞密度为1×105·mL-1接种于96孔板，分别取正常条件下、缺氧24 h和复氧1 h后培养的心肌细胞及加入3种不同浓度萝卜硫素及JAK2抑制剂后缺血和再灌条件下培养的心肌细胞，每组设置 6个复孔。收集细胞上清培养基及细胞，其中LDH活力用全自动生化分析仪，而MDA含量及SOD活力用相关试剂盒检测，操作步骤严格按照说明书进行。
1.8 JAK2/STAT3信号通路蛋白检测
按“1.7”项下操作收集细胞后，加入 RIPA裂解液，在冰上充分裂解细胞，BCA试剂盒检测蛋白浓度。蛋白煮沸后每孔上样量为30 μg，在12%的 SDS-PAGE凝胶中电泳分离，电压设置为恒压70 V；分离完成后在275 mV电流转膜90 min；再将膜用5%脱脂奶粉室温封闭1 h；一抗(稀释1∶1 000)孵育过夜，再二抗(稀释1∶3 000)孵育1 h，用TBST洗膜3次，用双色红外激光成像系统扫膜分析蛋白表达水平。
1.9 统计学分析
采用SPSS 19.0软件进行统计分析，实验数据用
表示，组间比较采用单因素方差分析检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 萝卜硫素对心肌细胞增殖的影响
CCK8实验对心肌细胞增殖情况检测结果提示，IRI细胞的相对存活率显著低于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)；而经过不同浓度萝卜硫素及JAK2抑制剂处理后，心肌细胞的相对存活率相对于IRI组显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，并且随着药物浓度的升高，心肌细胞的相对存活率也随之增高，表现出浓度依赖性。结果见图1。
图1 萝卜硫素对心肌细胞相对存活率的影响
与正常对照组比较，1)P＜0.05；与IRI组比较，2)P＜0.05。
Fig. 1 Effects of sulforaphane on relative survival rate of cardiac myocyte
Compared with normal control group,1)P＜0.05; compared with IRI group,2)P＜0.05.
2.2 各组细胞上清中 LDH活力及细胞匀浆中MDA含量和SOD活力检测
相关试剂盒对细胞上清中LDH活力及细胞匀浆中 MDA含量和 SOD活力检测结果说明，IRI组中 LDH和 MDA均显著高于正常对照组，而SOD活性则显著低于正常对照组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。相对于IRI组而言，经过不同浓度萝卜硫素及JAK2抑制剂处理后，LDH和MDA均显著降低，而SOD活性则显著升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，并且表现出浓度依赖性。结果见表1。
2.3 萝卜硫素对心肌细胞中 JAK2/STAT3信号通路的影响
免疫印迹实验对心肌细胞中 JAK2/STAT3信号通路蛋白表达水平检测提示，IRI细胞中 JAK2及STAT3磷酸化水平显著高于正常对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)；而经过不同浓度萝卜硫素及 JAK2抑制剂(1 μg·mL-1)处理后，心肌细胞细胞中JAK2及STAT3磷酸化水平相对于IRI组显著降低，差异具有统计学意义(P＜0.05)，并且随着药物浓度的升高，细胞中JAK2及STAT3磷酸化水平随之降低，表现出浓度依赖性。结果见图2。
表1 萝卜硫素对各组细胞上清中LDH活力及细胞匀浆中MDA含量和SOD活力的影响
Tab. 1 The effects of sulforaphane on MDA content and the activity of LDH and SOD
注：与正常对照组比较，1)P＜0.05；与IRI组比较，2)P＜0.05。
Note: Compared with normal control group,1)P＜0.05; compared with IRI group,2)P＜0.05.
图2 萝卜硫素对JAK/STAT3信号通路的影响(n=3)
与正常对照组比较，1)P＜0.05；与IRI组比较，2)P＜0.05。
Fig. 2 Effects of sulforaphane on JAK/STAT3 signaling pathway in cultured ventricular myocytes of neonatal rats(n=3)
Compared with normal control group,1)P＜0.05; compared with IRI group,2)P＜0.05.
3 讨论
本实验参照文献[9]在体外构建IRI细胞模型，从而达到诱导心肌细胞损伤的效果。因为酸碱平衡紊乱及离子浓度的变化等原因都会引起组织缺血，实验采用了模拟缺血与再灌注溶液来诱导IRI时离子浓度的变化与酸碱紊乱，并利用混合气替代空气来模拟低氧环境。实验检测的 3种指标中LDH是存在于胞浆中的酶类，它在细胞上清中的含量可以提示心肌细胞膜的损伤情况。MDA是心肌细胞中脂质过氧化反应的最终表现形式，因为心肌细胞受损会引起生物膜系统的脂质过氧化反应，会生成大量的MDA，而MDA又会膜内形成交链，造成膜成分多聚化，最后引起膜的流动性降低，膜结构发生变化及膜同构性增强。实验中IRI组细胞中LDH及MDA较高，并且显著高于正常对照组，说明细胞受损严重，模型构建成功。
JAK/STAT信号通路主要是由JAKs和STATs蛋白家族组成，并且这条通路广泛参与多种生物学效应，主要包括细胞氧化应激、增殖、分化和凋亡等[10-11]。JAK2/STAT3通路是JAK/STAT的重要成员之一，研究证实JAK2/STAT3信号通路在心肌的低氧/复氧损伤中有着重要调控作用，抑制JAK2/STAT3信号可明显增强线粒体抗氧化酶的生成，并进一步抑制H2O2及MDA等氧化应激产物的合成，降低再灌注心肌线粒体氧化应激损伤，抑制线粒体凋亡通路[12-14]。JAK2/STAT3信号通路的活化在心肌细胞受损中起着重要的作用，因此，通过调控对 JAK2/STAT3通路活化的抑制便可达到保护心肌细胞损伤的效果。前期也有研究发现，多种药物可通过抑制 JAK2/STAT3通路的活化起到保护心肌损伤的作用，如抵当汤可通过抑制JAK2/STAT3信号通路活化对糖尿病大鼠心肌组织起保护作用[15]。本实验研究也发现萝卜硫素可以抑制JAK2和STAT3蛋白的磷酸化，从而降低其介导的氧化应激损伤，主要包括抑制氧化应激相关产物LDH及MDA的产生，并且诱导SOD酶活性。综上所述，本实验发现萝卜硫可显著抑制JAK2/STAT3信号通路的活化，降低 JAK2和STAT3的磷酸化水平，从而对IRI损伤心肌细胞起到保护作用。
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