杨梅醇与5-对氟苄氧基杨梅醇的制备及其对人肝癌HepG2细胞活性的影响

童晔玲，戴关海*，任泽明，陈璇，聂晓静，杨锋

(浙江省中医药研究院，杭州 310007)

摘要：目的体外观察杨梅醇与5-对氟苄氧基杨梅醇(myricanol 5-fluorobenzyloxy ether，5FEM)对人肝癌细胞HepG2活性的影响。方法制备杨梅醇与5FEM，杨梅醇(25，12.5，6.25 μg·mL-1)、5FEM(25，12.5，6.25 μg·mL-1)作用于HepG2细胞，实时细胞分析系统记录96 h细胞指数，观察杨梅醇与5FEM对HepG2细胞增殖和迁移的影响。结果杨梅醇与5FEM对HepG2细胞的增殖和迁移均有较好的抑制作用，且呈现较好的量效关系，相等剂量下，5FEM的作用优于杨梅醇。结论杨梅醇与5FEM能有效抑制HepG2细胞的增殖和迁移。

关键词：杨梅醇；5-对氟苄氧基杨梅醇；人肝癌HepG2细胞；细胞增殖；细胞迁移

杨梅(Myrica rubraSieb.et Zucc)系杨梅科杨梅属植物，有较好的药用和食用价值。杨梅树皮味苦、性温，含有黄酮类、环状二芳基庚烷类、单宁类、三萜类等多种化合物[1]，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等活性[2-5]。杨梅醇是从杨梅树皮中提取的环状二芳基庚烷类化合物，笔者前期研究发现杨梅醇具有显著的抗肿瘤活性，对人肺腺癌A549、人早幼粒白血病HL-60、人肝癌HepG2细胞均有较好的抑制作用[6-7]。现将结构修饰后的5-对氟苄氧基杨梅醇(myricanol 5-fluorobenzyloxy ether，5FEM)与杨梅醇的抗HepG2活性进行比较。

1 材料

1.1 药物

杨梅醇与5FEM均为本实验室制备；杨梅醇对照品(云南西力生物技术有限公司，批号：BBP01843；纯度：98%)。

1.2 细胞株

人肝癌HepG2细胞(中国科学院细胞库)，本实验室液氮保存。

1.3 试剂

RPMI-1640培养液(吉诺生物医药技术有限公司，批号：16011505)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：20160323)；0.25%胰蛋白酶(含0.02%EDTA，吉诺生物医药技术有限公司，批号：2016062902)；PBS(吉诺生物医药技术有限公司，批号：2016061304)；0.4%台盼蓝(Sigma公司，批号：20151025)；甲苯、无水乙醇、石油醚、碳酸钾(K2CO3)、丙酮、氯仿(CHCl3)、碳酸铯(Cs2CO3)、氢氧化钠(NaOH)、二氯甲烷(DCM)、二甲基亚砜(DMSO)、盐酸、无水硫酸镁、丙酮等均为分析纯，由汇普化工仪器有限公司提供。

1.4 仪器

RE2000A型旋转式减压蒸发仪(成都市蜀华西部科技中心有限公司)；Centrifuge 5810R低温离心机(Eppendorf 公司)；BS210S电子天平(Sartorius公司)；层析柱(江苏建湖玻璃有限公司)；SKB-Ⅲ型水泵(河南太康科教器材厂)；waters H-class超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；核磁氢谱分析仪：Varian AS 400 FT-NMR specctrometer (400.13 MHz，美国Varian)；3111型CO2培养箱(Thermo公司)；HR40-Ⅱ-A2型医用净化工作台(青岛海尔特种电器有限公司)；CK40-F200型倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)；xCELLigence RTCA DP多功能实时无标记细胞分析仪、E-Plate 16(批号：20160310)、CIM-Plate 16检测板(批号：20160308)均来自艾森生物(杭州)有限公司；超低温冰箱(Thermo公司)；TC-20细胞计数仪(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 杨梅醇的制备

取干燥清洁的杨梅树皮药材1 000 g，剪碎，置于蒸馏烧瓶中，加3 000 mL的80%乙醇，80 ℃水浴回流提取2次，每次2 h，合并2次提取液，过滤，滤液减压浓缩，回收乙醇，干燥，得醇提物，醇提物加水热溶后，依次用1.6倍量石油醚、氯仿各萃取2次，合并各萃取液，分别于旋转蒸发仪上80 ℃回收溶剂，真空减压干燥至恒重，得氯仿萃取物，再用凝胶柱结合用TLC、UPLC分离得到杨梅醇。

2.2 5FEM的制备

在圆底烧瓶中加入杨梅醇0.05 g，溶于5 ml丙酮中，搅拌溶解，加入K2CO30.063 g，搅拌1 h后，加入4-氟苄溴0.085 g，避光、室温下反应。TLC检测反应至杨梅醇点消失。将得到的反应液用旋转蒸发仪蒸去溶剂，加入0.1 g硅胶拌样。取300~400目硅胶装柱，压实后用石油醚压柱3次，将拌好的样品用刮刀刮出(尽量刮净)，装样。用石油醚-乙酸乙酯(3∶1)做层析液，连续收集层析液，点板确定所含产品的纯度，收集层析液，合并，旋干。旋干后得到的黄色固体即为5FEM。

2.3 细胞培养

人肝癌HepG2细胞用含10%胎牛血清的1640培养液，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养，取对数生长期的细胞用台盼蓝染色，检测细胞存活率≥95%，即可用于实验。

2.4 细胞形态学观察

倒置显微镜观察经杨梅醇与5FEM作用后的细胞形态学改变。

2.5 实时细胞分析系统检测杨梅醇与5FEM对HepG2细胞增殖的影响

取对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×104·mL-1，先在E-Plate板上每孔放入50 μl培养基测基线，随后加入100 μl细胞悬液，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，记录细胞指数(cell index，CI)。24 h后加入杨梅醇(25，12.5，6.25 µg·mL-1)和5FEM(25，12.5，6.25 μg·mL-1)，同时设正常对照组、5-FU 10 μg·mL-1组，每组设3复孔，继续培养72 h，记录CI值。

2.6 实时细胞分析系统检测杨梅醇与5FEM对HepG2细胞迁移的影响

取对数生长期的HepG2细胞，胰酶消化后制成单细胞悬液，调整细胞浓度为4×105·mL-1，先在CIM-Plate板下室每孔放入165 μl含血清培养基，随后装配上室后加入30 μl无血清培养基测基线，再加入100 μl无血清细胞悬液，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，记录CI值。24 h后加入杨梅醇(25，12.5，6.25 µg·mL-1)和5FEM(25，12.5，6.25 μg·mL-1)，同时设正常对照组、5-FU 10 µg·mL-1组，每组设3复孔，继续培养72 h，记录CI值。

2.7 统计学方法

各组数据用表示，多组间均数比较采用方差分析，所有数据均由SPSS 17.0统计软件进行处理，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 杨梅醇与5FEM的制备

分离得到杨梅醇的纯度为98.2%，5FEM为 0.057 g，5FEM核磁氢谱图见图1。

3.2 细胞形态学观察

细胞经杨梅醇与5FEM处理48 h后，镜下均可见细胞由贴壁不同程度脱落，光镜下见细胞变圆，体积缩小，细胞质内可见较多颗粒，并出现片状无细胞生长区。对照组细胞呈多角形，贴壁生长，几乎无脱落，光镜下见细胞完整，胞质饱满，相邻细胞生长融合成片。结果见图2。

图1 5FEM核磁氢谱图

Fig. 1 5FEMnuclear magnetic spectrum

图2 细胞形态学观察(100×)

A-对照组；B-杨梅醇12.5 μg·mL-1；C-5FEM 12.5 μg·mL-1。

Fig. 2 Cell morphological observation(100×)

A-control group; B-myricanol group(12.5 μg·mL-1); C-5FEM group (12.5 μg·mL-1).

3.3 杨梅醇与5FEM对HepG2细胞增殖的影响

给药后，杨梅醇(25，12.5，6.25 μg·mL-1)、5FEM(25，12.5，6.25 μg·mL-1)组的CI值均低于正常对照组，且呈剂量相关性。结果见图3。

图3 杨梅醇和5FEM对HepG2细胞增殖的影响

Fig. 3 The effect of myricanol and 5FEM on cell proliferation

给药后24，48 h，与正常对照组相比，杨梅醇(25，12.5 μg·mL-1)、5FEM(25，12.5，6.25 μg·mL-1)组的CI值均显著减低(P<0.01)。与5-FU组相比，杨梅醇(25，12.5 μg·mL-1)和5FEM(25，12.5 μg·mL-1) 的24 h CI值明显降低(P<0.01)；杨梅醇25 μg·mL-1组与5FEM 25 μg·mL-1组的48 h CI值显著降低(P<0.01)。结果见表1。

3.4 杨梅醇与5FEM对HepG2细胞迁移的影响

给药后，杨梅醇(25，12.5，6.25 μg·mL-1)、5FEM(25，12.5，6.25 μg·mL-1)组的CI值均低于正常对照组，且呈剂量相关性。结果见图4。

表1 杨梅醇和5FEM对HepG2细胞增殖的影响(n=3,)

Tab. 1 The effect of myricanol and 5FEM on cell proliferation(n=3,)

组别浓度/μg·mL-1CI值 给药后24 h 给药后48 h 正常对照组-2.014±0.0122.660±0.011 5-FU组101.475±0.0111)0.911±0.0061) 杨梅醇组250.945±0.0041)2)0.855±0.0061)2) 12.51.237±0.0141)2)1.522±0.0041)2) 6.251.873±0.0352)2.538±0.0081)2) 5FEM组250.850±0.0011)2)0.844±0.0031)2) 12.51.142±0.0041)2)1.346±0.0011)2) 6.251.492±0.0061)1.841±0.0051)2)

注：与正常对照组相比，1)P<0.01；与5-FU组相比，2)P<0.01。

Note: Compared with control group,1)P<0.01; compared with 5-FU group,2)P<0.01.

图4 杨梅醇和5FEM对HepG2细胞迁移的影响

Fig. 4 The effect of Myricanol and 5FEM on cell migration

给药后24，48 h，与正常对照组相比，杨梅醇(25，12.5 μg·mL-1)、5FEM(25，12.5，6.25 μg·mL-1)组的CI值显著减低(P<0.01)。与5-FU组相比，杨梅醇(25，12.5 μg·mL-1)和5FEM(25，12.5，6.25 μg·mL-1) 的24 h CI值明显降低(P<0.01)；杨梅醇25 μg·mL-1和5FEM(25，12.5 μg·mL-1)的48 h CI值显著降低(P<0.01)。结果见表2。

表2 杨梅醇和5FEM对HepG2细胞迁移的影响(n=3)

Tab. 2 The effect of myricanol and 5FEM on cell migration(n=3)

组别浓度/μg·mL-1CI值 给药后24 h 给药后48 h 正常对照组-1.782±0.0242.238±0.004 5-FU组101.381±0.0131)2)0.908±0.0111)2) 杨梅醇组251.011±0.0091)2)1.234±0.0031)2) 12.51.146±0.0221)2)1.710±0.0081)2) 6.251.659±0.0032)1.918±0.0081)2) 5FEM组250.535±0.0031)2)0.456±0.0031)2) 12.50.909±0.0031)2)0.858±0.0061)3) 6.251.177±0.0101)2)1.700±0.0141)2)

注：与正常对照组相比，1)P<0.01；与5-FU组相比，2)P<0.01，3)P<0.05。

Note: Compared with control group,1)P<0.01; compared with 5-FU group,2)P<0.01,3)P<0.05.

4 讨论

杨梅醇属于环状二芳基庚烷类化合物，在杨梅树皮中含量丰富(达到0.7%)，杨梅醇具有多种生物学活性，包括逆转阿尔茨海默氏病[8]、抑制一氧化氮的产生[9]、预防肝损伤[10]、抗雄激素活性[11]、诱导肿瘤细胞凋亡[12]等作用。

目前，对杨梅醇的结构修饰仍处于初步研究阶段，而对杨梅醇进行结构修饰用于抗肿瘤的研究仍是一片空白。本课题组通过结构修饰得到了25个杨梅醇衍生物，并获得了相关专利[13]。课题组前期研究发现，不同剂量的杨梅醇、5-苄氧基杨梅醇、5FEM及5-对溴苄氧基杨梅醇(3.13~ 100.0 μg·mL-1)对A549、HepG2及HL-60细胞均有明显的抑制作用，并有很好的量效关系，其中5FEM对HL-60细胞抑制作用尤为明显，而对正常细胞HLF1的毒性较5-苄氧基杨梅醇及5-对溴苄氧基杨梅醇小，这为5FEM的进一步开发应用提供了依据。

课题组又运用RTCA技术对杨梅醇和5FEM的抗人肝癌HepG2细胞活性进行了评价。RTCA技术是一种建立在阻抗基础上的瞬时细胞电感应连续记录系统[14]，与传统的MTT法、同位素掺入法等相比具有无标记、非损伤、自动、实时、连续检测的技术优势，可以全程动态记录处理之后细胞的效应变化，获得效应变化起始时间点，最大效应的时间点等多种信息，适用于细胞生物学研究的各个领域，尤其对肿瘤学研究具有其独特的优势，可应用于肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡，以及免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤等众多领域，从而进行抗肿瘤药物的筛选。

本研究结果显示，杨梅醇和5FEM对HepG2细胞的增殖和迁移均有较好的抑制作用，且呈现较好的量效关系，相等剂量下，5FEM的作用优于杨梅醇，这可能与降低HepG2细胞中caspase-9和Bcl-2基因和蛋白的表达水平，提高p21基因和蛋白以及Bax蛋白的表达水平相关[1,6-7]。本研究结果为杨梅醇和5FEM抗肿瘤新药的进一步研发提供了实验依据，本课题组后续也将继续进行杨梅醇和5FEM抗肿瘤作用机制的研究。

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(本文责编：蔡珊珊)

Preparation of Myricanol and Myricanol 5-fluorobenzyloxy Ether and its Effect on the Activity of HepG2Cells

TONG Yeling, DAI Guanhai*, REN Zeming, CHEN Xuan, NIE Xiaojing, YANG Feng

(Zhejiang Institute of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310007, China)

ABSTRACT: ObjectiveTo observe the activity of myricanol and myricanol 5-fluorobenzyloxy ether (5FEM) on liver cancer of cell HepG2invitro.MethodsMyricanol (25, 12.5 and 6.25 μg·mL-1) and 5FEM (25, 12.5 and 6.25 μg·mL-1) were prepared to act on HepG2cells, real time cellular analysis was used to record 96 h cell index (CI) to observe the effect of Myricanol and 5FEM on the proliferation and migration of HepG2cells.ResultsMyricanol and 5FEM could inhibit the proliferation and migration of HepG2cells, showing a dose-effect curve. The effect of 5FEM was better than myricanol at the same dose.ConclusionMyricanol and 5FEM can effectively inhibit the proliferation and migration of HepG2cells.

KEY WORDS:myricanol; myricanol 5-fluorobenzyloxy ether; HepG2cell; proliferation; migration

中图分类号：R285.4

文献标志码：A

文章编号：1007-7693(2018)03-0375-04

DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.03.014

引用本文：童晔玲，戴关海，任泽明，等. 杨梅醇与5-对氟苄氧基杨梅醇的制备及其对人肝癌HepG2细胞活性的影响[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(3): 375-378.

收稿日期：2017-07-24

基金项目：浙江省科技计划项目(2015F10015、2013F50020、2017C33169)

作者简介：童晔玲，女，硕士，副研究员 Tel: (0571)88849082 E-mail: tongyeling@sina.com

*通信作者：戴关海，男，硕士，研究员 Tel: (0571)88849082 E-mail: 13989494472@163.com