黄文康1，岳超2，宋剑锋3，丁国琴4，张文婷2*，赵维良2*
(1.浙江中医药大学，杭州 310053；2.浙江省食品药品检验研究院，杭州 310052；3.衢州市食品药品检验研究院，浙江 衢州 324000；4.杭州市中医院，杭州 310007)
摘要：目的 建立HPLC同时测定衢枳壳中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、川陈皮素和桔皮素含量。方法 采用Agilent Extend C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，检测波长：330 nm，以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，流速：1 ml·min-1，柱温：30 ℃。结果 芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、川陈皮素、桔皮素分别在23.30~1 164.80 ng，170.84~8 541.91 ng，17.22~861.20 ng，156.17~7 808.64 ng，3.13~156.48 ng，0.90~45.23 ng，0.85~42.27 ng内线性关系良好(r≥0.999 5，n=6)，平均回收率分别为98.8%，101.3%，98.3%，96.8%，101.8%，101.7%，108.9%。结论 首次建立了衢枳壳中7个成分HPLC含量测定方法，该方法简便，结果准确，可为综合评价衢枳壳质量提供依据。
关键词：衢枳壳；高效液相色谱法；芸香柚皮苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷；木犀草素；川陈皮素；桔皮素
衢枳壳为芸香科植物常山胡柚Citrus changshan-huyou Y.B.Chang的干燥未成熟果实，7月果皮尚绿时采收，主产浙江，以常山为重点产区。现代药理研究表明胡柚主要有效成分为黄酮[1]，具有抗菌、抗氧化、降血脂和降氧化等作用[2-5]。胡柚青果在民间药用历史悠久，具有镇咳化痰、清热解毒、解酒醒脑等药用价值，但其质量评价和控制研究尚未完善，质量控制研究报道较少，宋剑锋等[6]建立了胡柚花和胡柚青果中柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的HPLC含量测定方法，赵庆春等[7]建立了胡柚汁中柚皮芸香苷、柚皮苷和新橙皮苷的HPLC含量测定方法，郅景梅等[8]建立了HPLC测定胡柚皮中桔皮素和甜橙素含量的方法，其他成分含量分析未见报道。本实验首次建立了HPLC同时测定芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、桔皮素和川陈皮素7个成分含量测定方法，为进一步完善衢枳壳质量评价和控制提供参考依据。
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；CP225D电子分析天平(德国赛多利斯)；4020P超声波清洗器(韩国JAC公司)。
柚皮苷对照品(批号：110722-201312；含量按94.7%计)、橙皮苷对照品(批号：110721-201316；含量按95.3%计)、新橙皮苷对照品(批号：111857-201102；含量按99.6%计)和木犀草素对照品(批号：111520-200504；供含量测定用)均购自中国药品生物制品检定研究院；芸香柚皮苷对照品(批号：131208；含量>98%)、桔皮素对照品(批号：130708；含量>98%)和川陈皮素对照品(批号：130108；含量>98%)均购自维克奇生物科技有限公司。乙腈(色谱纯，美国Merck公司)，其余试剂为分析纯，实验用水为超纯水。
实验共收集不同产地样品11批，经浙江省食品药品检验研究院郭增喜主任中药师鉴定，均为芸香科植物常山胡柚Citrus changshan-huyou Y. B. Chang的果实，详见表1。
表1 样品信息表
Tab. 1 Sample information
取衢枳壳粗粉0.3 g精密称定，加50%甲醇适量，超声20 min，放冷至室温，加50%甲醇定容至25 mL量瓶中，摇匀，离心，取上清液，即得。
取对照品适量，精密称定，加50%甲醇分别制成每1 ml含芸香柚皮苷46.59 μg，柚皮苷360.80 μg，橙皮苷3.45 μg，新橙皮苷312.35 μg，木犀草素6.26 μg，桔皮素1.01 μg，川陈皮素1.09 μg的混合对照品溶液，即得。
色谱柱：Agilent Extend C18柱(4.6 mm× 250 mm，5 mm)。流动相：乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)。梯度洗脱：0~2 min，10%A；2~5 min，10%→18%A；5~10 min，18%A；10~25 min，18%→20%A；25~45 min，20%→50%A；45~70 min，50%→100%A。检测波长：330 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 ml·min-1。
分别精密吸取混合对照品溶液5 μl，供试品溶液10 μl，按“2.3”项下色谱条件进行测定，结果样品中各成分达到基线分离，理论板数按柚皮苷峰计算应≥3 000。色谱图见图1。
图1 高效液相色谱图
A -混合对照品；B-样品；1-芸香柚皮苷；2-柚皮苷；3-橙皮苷；4-新橙皮苷；5-木犀草素；6-桔皮素；7-川陈皮素。
Fig. 1 HPLC Chromatograms
A- standards solution; B-sample; 1-narirutin; 2-naringin; 3-hesperidin; 4-neohesperidin; 5-luteolin; 6-nobiletin; 7-hesperetin.
2.5.1 线性范围考察 将“2.2”项下混合对照品溶液分别进样1，5，10，20，30，40，50 μl，按“2.3”项下色谱条件进行测定，以色谱峰面积(Y)对进样量(X)进行回归，计算回归方程，结果见表2。
2.5.2 仪器精密度 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液5 μl，按“2.3”项下色谱条件重复进样6次，记录色谱峰峰面积，计算色谱峰面积RSD。芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、桔皮素和川陈皮素RSD(n=6)均≤2.0%，表明仪器精密度良好。
表2 7种指标成分的线性关系
Tab. 2 Linearity of determination of 7 index componenes
2.5.3 重复性试验 精密称量同一批号供试品(S1)6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进行测定并计算含量。芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、川陈皮素、桔皮素的平均含量分别为7.318 3，52.453 9，4.870 5，50.616 9，0.129 7，0.277 2，0.174 7 mg·g-1，RSD分别为1.21%，0.75%，1.15%， 0.75%，2.69%，0.78%，0.53%，表明方法的重复性良好。
2.5.4 加样回收率试验 精密称取同一批供试品(S1)6份，分别精密加入芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、川陈皮素、桔皮素对照品，按“2.1”项下供试品制备方法制备并按“2.3”项下色谱条件进行测定，计算回收率和RSD，结果见表3。
2.5.5 稳定性实验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液和重复性试验(S1)的供试品溶液，分别在0，6，9，16，20，25 h进样，按“2.3”项下色谱条件测定，记录峰面积，计算RSD。芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、木犀草素、川陈皮素、桔皮素的对照品峰面积的RSD(n=6)分别为1.7%，1.9%，2.6%，1.8%，1.4%，1.6%，1.8%；供试品峰面积RSD(n=6)分别为1.70%，0.50%，0.82%，0.54%，1.72%，0.48%，0.52%，表明对照品溶液和供试品溶液在25 h内基本稳定。
分别取实验收集的11批样品，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件对7个成分进行检测，计算含量，结果见表4。
将混合对照品溶液用HPLC-DAD进行检测，经DAD光谱分析，结果在330 nm波长处可兼顾各成分的紫外吸收，故以330 nm作为检测波长。
表3 7种指标成分加样回收率测定结果
Tab. 3 Results of recovery test for 7 index componenes
表4 衢枳壳中7种指标成分的含量测定结果(n=2)
Tab. 4 Contents of seven componenes in Citrus changshan- huyou Y.B.Chang (n=2) mg·g-1
实验对提取溶剂(30%甲醇、50%甲醇、80%甲醇)、提取方式(超声、回流)、提取时间(10，20，30 min)、取样量(0.1，0.3，0.5 g)，综合考虑色谱峰峰面积、分离度、峰形和供试品制备方法的简单高效，故确定供试品制备方法：取衢枳壳粗粉0.3 g精密称定，置25 ml量瓶中，加50%甲醇适量，超声20 min，放冷至室温，加50%甲醇至刻度，摇匀，离心，取上清液，即得。
实验对Agilent Extend XDB C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)、Agilent Eclipse C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)、Kromasil 100-5 C18(250 mm× 4.6 mm，5 μm)和Diamond C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)4根色谱柱进行分析，结果各组分均能达到有效分离；在25，30，35 ℃柱温条件下进行分析，不同柱温下各化合物均能达到有效分离，仅影响相对保留时间。综上表明实验色谱条件具有良好的耐用性。
芸香柚皮苷、柚皮苷和新橙皮苷成分在衢枳壳中含量相对较高，衢枳壳中芸香柚皮苷的含量范围为4.623~16.120 mg·g-1，柚皮苷的含量范围为26.569~72.700 mg·g-1，新橙皮苷的含量范围为29.722~67.428 mg·g-1，其余成分含量较低。不同采集地衢枳壳成分含量差异明显。本方法简便、高效、准确、可靠，可为衢枳壳质量全面、准确的评价和控制提供参考。
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(本文责编：曹粤锋)
Simultaneous determination of seven constituents in Citrus changshanhuyou Y. B. Chang by HPLC
HUANG Wenkang1, YUE Chao2, SONG Jianfeng3, DING Guoqin4, ZHANG Wenting2*, ZHAO Weiliang2*
(1.Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2.Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310052, China; 3.Quzhou Institute for Food and Drug Control, Quzhou 324000, China; 4.Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310007, China)
ABSTRACT: OBJECTIVE To establish a method for the simultaneous determination of the contents of narirutin, naringin, hesperidin, neohesperidin, luteolin, nobiletin and hesperetin of Citrus changshan-huyou Y.B.Chang by HPLC.METHODS The HPLC method was adopted with Agilent Extend C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was acetonitrile and 0.1% methanoic acid with gradient elution. The flow rate was 1 mL·min-1. The detection wavelength was 330 nm and column temperature was 30 ℃.RESULTS The linear relation of narirutin, naringin, hesperidin, neohesperidin, luteolin, nobiletin and hesperetin was excellent within the range of 23.30-1 164.80 ng, 170.84-8 541.91 ng, 17.22-861.20 ng, 156.17-7 808.64 ng, 3.13-156.48 ng, 0.90-45.23 ng, 0.85-42.27 ng (r≥0.999 5, n=6), and the mean recovery was 98.8%, 101.3%, 98.3%, 96.8%, 101.8%, 101.7%, 108.9%.CONCLUSION It is the first time to establish the HPLC method of the simultaneous determination for the seven contents of Citrus changshan-huyou Y.B.Chang. The method is simple, reliable and accurate, which provides the reference for the quality control for Citrus changshan-huyou Y.B.Chang.
KEY WORDS: Citrus changshan-huyou Y.B.Chang; HPLC; narirutin; naringin; hesperidin; neohesperidin; luteolin; nobiletin; hesperetin
中图分类号：R917.101
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2018)03-0404-04
DOI: 10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.03.021
引用本文：黄文康, 岳超, 宋剑锋, 等. HPLC同时测定衢枳壳中7种指标成分的含量[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(3): 404-407.
收稿日期：2017-07-11
作者简介：黄文康，男，硕士生 Tel: 15858111454 E-mail: 846087613@qq.com
*通信作者：张文婷，女，博士，主任中药师 Tel: (0571)86459425 E-mail: leozhwt@163.com 赵维良，男，硕士，主任中药师 Tel: (0571)86452373 E-mail: zwl@zjyj.org.cn