芦丁具有降低毛细血管异常通透性和脆性的作用，临床主要用于高血压病的辅助治疗。二维芦丁片是由维生素C 、维生素B6、芦丁制成的复方制剂，用于高胆固醇血症及动脉粥样硬化治疗。亚油酸维生素E胶丸/二维芦丁片由杭州华东医药集团五丰制药厂生产。目前执行国家药品监督管理局国家药品标准试行 WS-10001-(HD-1263)-2002，国内外药典(中国药典、USP、BP、EP和JP)均未见收载。试行标准中采用 UV法测定芦丁含量，专属性差，前处理过程产生的误差很大，因此本实验将芦丁的含量测定方法由 UV法改为HPLC；试行标准二维芦丁片中未设溶出度检查项，考虑到芦丁为水难溶性药物，因此本实验研究了芦丁的溶出度检查方法。本实验参照中国药典2015年版曲克芦丁的液相色谱条件，和相关的含量[1-3]和溶出度[4-5]文献，研究建立了HPLC测定二维芦丁片中芦丁溶出度和含量的方法，并在标准中增订了芦丁的溶出度检查，将芦丁的含量测定方法由UV法改为了HPLC，经方法学试验，方法简便、可行，可用于本品的质量控制。
1 仪器与试药
LC-20AD液相色谱仪(日本岛津，包括在线真空脱气机，二元泵，自动进样系统等)；AT7型溶出仪(瑞士 SOTAX，采用针式取样方式)；Hanson在线过滤器(孔径 10 μm)。
水为蒸馏水；乙腈为色谱纯；磷酸二氢钠、戊烷磺酸钠均为分析纯；芦丁对照品(中国食品药品检定研究院，批号：10080-201409，含量：91.1%)；二维芦丁片及空白辅料(杭州华东医药集团五丰制药厂，规格：10 mg，批号：16062001，16011901，16062202)。槲皮素对照(中国食品药品检定研究院，批号：10081-201509，纯度为98.6%)。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
二维芦丁片为复方制剂，且芦丁规格小，因此采用专属性强的 HPLC测定本品中芦丁的溶出度和含量。
2.1.1 含量测定色谱条件 色谱柱：Thermo C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以磷酸盐缓冲液(0.l mol·L-1磷酸二氢钠溶液，用磷酸调节 pH 值至 4.4)-乙腈(80∶20)为流动相，检测波长为254 nm；流速：1.0 mL·min-1，柱温：30 ℃，进样量：10 µL。
2.1.2 溶出度色谱条件 进样量：20 µL，其他条件同含量测定色谱条件。
2.2 溶出度测定
2.2.1 二维芦丁片在 4种溶出介质中的溶出曲线和溶出条件的选择 取本品，照溶出度与释放度测定法(中国药典2015年版通则0931第二法[6])，分别以4种溶剂[分别为水、pH 1.2的盐酸溶液、2 mol·L-1醋酸溶液(pH 4.0)、pH 6.8 磷酸盐缓冲液，4种溶出介质中均含 0.5%SDS]900 mL为溶出介质，转速为75 r·min-1，依法操作，经5，10，15，30，45，60 min时，取溶出液5 mL，作为供试品溶液，并及时补足溶出介质。另精密称取芦丁对照品11 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇适量，超声使芦丁溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件测定，取供试品溶液和对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算每片芦丁的溶出量，结果见图1。
通过上述研究，确定溶出度检查的条件为：桨法，以水(含0.5% SDS)900 mL为溶出介质，转速为 75 r·min-1，45 min 取样。
图1 二维芦丁片在4种溶出介质中的溶出曲线图A-pH 1.2；B-pH 4.0；C-pH 6.8；D-水。
Fig. 1 The dissolution profile of Two-dimensional Rutin tablets in four dissolution media A-pH 1.2; B-pH 4.0; C-pH 6.8; D-water.
2.2.2 溶出度测定方法 取本品，照溶出度与释放度测定法(中国药典 2015年版通则 0931第二法)，以 0.5% SDS 900 mL为溶出介质，转速75 r·min-1，依法操作，经 45 min 时，取溶液 10 mL，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取芦丁对照品约11 mg，精密称定，置20 mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件，取供试品溶液和对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算每片芦丁(C27H30O16·3H2O)的溶出量。限度为标示量的75%，应符合规定。
2.2.3 方法学试验
2.2.3.1 线性关系 精密称取芦丁对照品适量，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取适量，加水(含 0.5% SDS)稀释制成系列浓度溶液，按“2.1.2”项下色谱条件测定。结果回归方程：A=-1 226.499 3+18 590.399 6C，相关系数 r=1.000 0。结果表明，对照品溶液浓度在2.26～22.56 μg·mL-1内与峰面积有良好的线性关系。
2.2.3.2 溶出度其他成分的干扰试验 按处方比例，制成不含芦丁的空白样品，取适量，加水(含0.5% SDS)适量，超声振荡，并稀释至规定浓度，摇匀。滤过，取滤液照“2.1.2”项下色谱条件测定，结果表明其他成分对芦丁的溶出度测定无干扰，见图3。
2.2.3.3 回收率试验 按处方比例，分别精密称取相当于样品标示量的 50%，70%，100%的芦丁对照品及相应量的空白辅料，加甲醇适量，超声振荡使芦丁溶解，并加水(含0.5% SDS)至规定浓度，摇匀，滤过，按“2.1.2”项下色谱条件测定，对本法的回收率进行考察。结果见表1。可见本法的回收率较高，可用于溶出度的测定。
表1 溶出度的回收率测定结果(n=9)
Tab. 1 The results of recovery for dissolution(n=9)
2.2.3.4 溶液的稳定性 取供试品溶液，按“2.1.2”项下色谱条件测定，于0，2，4，8 h测定，结果RSD为1.3%，溶液在8 h内稳定。
2.2.4 样品的溶出度测定结果 取杭州华东医药集团五丰制药厂样品3批，照溶出度测定法(中国药典 2015年版通则 0931第二法)，以水(含0.5%SDS)为溶出介质，转速为75 r·min-1，依法操作，在5，10，15，30，45，60 min时，分别取溶液10 mL，滤过，并及时在操作容器中补充上述溶剂10 mL。另精密称取芦丁对照品11 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇适量，超声使芦丁溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL，置100 mL量瓶中，用溶出介质稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件测定，取供试品溶液和对照品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算每片的溶出量。
结果见图2～3。根据溶出曲线试验结果，将取样时间定为45 min，限度定为75%。
2.3 含量测定
2.3.1 溶液的配制 精密称取芦丁对照品约10 mg，精密称定，置 50 mL量瓶中，加甲醇约10 mL，超声使溶解，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为含量测定的对照品溶液；取本品20 片，精密称定，研细，取细粉适量(约相当于芦丁50 mg )，精密称定，置50 mL量瓶中，加甲醇适量，超声使芦丁溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 mL，置25 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，作为含量测定的供试品溶液。
图2 3批二维芦丁片的溶出曲线
A-16062001；B-16011901；C-16062202。
Fig. 2 Dissolution curves of two batchs of Two-dimensional Rutin tablets.
A-16062001; B-16011901; C-16062202.
图3 溶出色谱图
A-对照品溶液；B-供试品溶液(批号：16011901)；C-空白样品溶液；1-芦丁。
Fig. 3 Dissolution chromatogram
A-standard solution; B-sample solution(batch 16011901); C-blank;1-rutin.
2.3.2 系统适用性试验 取芦丁对照品和槲皮素对照品各适量，加甲醇适量使溶解，用流动相稀释制成每l mL中分别约含0.2 mg和2 µg的溶液，作为系统适用性溶液，取10 µL按“2.1.1”项下的色谱条件进行分析，记录色谱图，结果见图4，芦丁峰与槲皮素峰的理论板数分别为8 967，9 521，芦丁峰与槲皮素峰之间的分离度为35.75。
图4 系统适用性试验色谱图
1-芦丁；2-槲皮素。
Fig. 4 Chromatogram of system suitability test
1-rutin; 2-quercetin.
2.3.3 方法专属性试验
2.3.3.1 芦丁与槲皮素的分离 取“2.3.1”项下的系统适用性溶液10 µL，按“2.1.1”项下色谱条件测定，确定芦丁和槲皮素的保留时间，考察两者之间的分离度，结果见图4。结果表明，在上述色谱条件下，芦丁与槲皮素完全分离。
2.3.3.2 强力破坏试验 分别取 5份芦丁原料药和二维芦丁片细粉各适量，其中 2份分别加入0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液 0.5 mL 和 0.1 mol·L-1盐酸溶液0.5 mL，加入碱的那份放置0.5 h后中和，加入酸的那份放置1 h后中和；一份加3%过氧化氢溶液0.5 mL，放置2 h；另外2份分别在105 ℃下放置3 h和于强光下(4 500 lx)照射5 d，分别加甲醇适量，超声使芦丁溶解，用流动相稀释制成每1 mL中约含0.2 mg的溶液，滤过，取上述处理后的溶液各10 μL进样分析，结果芦丁对强光、碱、氧化破坏基本稳定，在酸、高温破坏下，有降解产物产生，产生的主要降解产物是槲皮素，对主峰含量测定无干扰。
2.3.3.3 其他峰干扰 按二维芦丁片处方制备不含芦丁的缺味溶液，进样，记录色谱图。结果表明二维芦丁片中的辅料、维生素C和维生素B6，对芦丁的含量测定无干扰，色谱图见图5。
2.3.4 方法学试验
2.3.4.1 线性关系 精密称取芦丁对照品适量，加甲醇适量，超声使溶解，用流动相定量稀释制成每1 mL中约含0.04，0.10，0.20，0.30和0.40 mg的溶液。按“2.1.1”项下色谱条件测定。得线性方程为 A=1.96×107C-1.7×103，r=1.000 0(n=5)。结果表明，芦丁在0.04～0.40 mg·mL-1内线性良好。
2.3.4.2 回收率试验 按处方比例，分别精密称取相当于样品标示量的80%，100%，120%的芦丁对照品及相应量的空白辅料，加甲醇适量，超声使芦丁溶解，并加流动相稀释至规定浓度，摇匀，滤过，按“2.1.2”项下色谱条件测定，对本法的准确度进行考察。结果见表2。
2.3.4.3 仪器精密度试验 取批号为 16062001的样品 6份，照确定的含量测定方法测定，结果RSD为0.6%。
2.4 样品含量测定
取 3批样品，照确定的方法，进样测定，结果批号为16062001，16011901，16062202的4批样品，含量分别为 99.5%，99.5%，99.1%，含量测定HPLC色谱图见图5。
表2 芦丁测定回收率测定结果(n=9)
Tab. 2 The results of recovery for rutin(n=9)
图5 含量测定典型色谱图
A-对照品溶液；B-供试品溶液(批号：16011901)；C-空白样品溶液；1-芦丁。
Fig. 5 Typical chromatogram of content determination
A-standard solution; B-sample solution(batch 16011901); C-blank;1-rutin.
3 讨论
3.1 芦丁在4种溶出介质中的溶解度和表面活性剂SDS浓度的选择
取芦丁原料药10 mg，置带塞三角瓶中，分别加入pH 1.2盐酸缓冲液、pH 4.0醋酸缓冲液、水和pH6.8磷酸缓冲液4种溶出介质250 mL，振摇，在37 ℃水浴中放置3 h，其间每隔0.5 h取出振摇一次。结果芦丁在 4种溶出介质均未完全溶解，在水和pH 4.0醋酸缓冲液中的溶解度大于pH 1.2盐酸溶液中的溶解度，在pH 6.8磷酸缓冲液中的溶解度最差。
因此在溶出介质中需添加表面活性剂 SDS。试验了在4种溶出介质中分别添加0.1%，0.2%，0.3%，0.4%和0.5%SDS，结果添加0.1%，0.2%，0.3%，0.4%SDS，芦丁在 4种溶出介质均未完全溶解；添加0.5%SDS，芦丁在水和pH 4.0醋酸缓冲液中溶解完全，在pH 1.2盐酸溶液中未完全溶解，在pH 6.8磷酸缓冲液中的溶解较差。因此在溶出介质中添加0.5%SDS。
3.2 溶出介质的选择
根据二维芦丁片在4种溶出介质中(pH 1.2盐酸缓冲液，pH 4.0醋酸缓冲液，水和pH 6.8磷酸缓冲液且均含 0.5%SDS)的溶出曲线，确定水(含0.5% SDS)900 mL为溶出介质最佳。
3.3 转速的选择
比较了浆法转速为 75 r·min-1和转速为50 r·min-1的溶出度，结果表明，转速为 50 r·min-1，溶出度低；转速为75 r·min-1，45 min可基本完全溶出。因此转速选择75 r·min-1。
3.4 滤膜的吸附作用考察
水(含 0.5% SDS)为溶出介质的溶出液经滤膜过滤(津隆MICRO PES 聚醚砜，水系，0.45 μm)，与离心过后的溶出液比较，HPLC测定。经滤膜过滤后峰面积为139 117，离心后峰面积为139 931，说明水(含 0.5% SDS)为溶出介质，滤膜对芦丁无吸附。
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