硫磺熏蒸法是一种中药材常用的加工方法，可起到防虫、防霉、防腐等作用，且药材外观色泽亮丽[1]，如党参、山药、天麻等药材传统习用硫磺熏蒸。现代研究发现，硫熏后会使中药材残留二氧化硫(SO2)及砷(As)、汞(Hg)等重金属[2]，其药效及安全性存在明显差异[3-5]。目前中药材二氧化硫残留量超标已十分严重[6-7]，中国药典2015年版规定党参药材中二氧化硫残留量不得大于400 mg·kg-1[8]281，但研究表明，部分党参药材二氧化硫残留量超过规定的4倍[9]。硫熏不仅影响中药药效及安全性，还可能会破坏药材化学成分[10-14]。党参主要含有糖类、苷类、甾体类等成分，其中，党参多糖具有清除自由基、调节机体免疫力等作用[15]；党参炔苷对胃黏膜损伤具有很好的保护作用，是党参保护胃黏膜的活性成分之一[16]；5-羟甲基糠醛(5-HMF)具有抗氧化、改善血液流变学等生物活性[17-18]。目前尚缺乏不同剂量硫磺熏蒸对党参化学成分的影响及硫熏党参饮片不同贮藏期化学成分变化的研究报道。本研究考察不同剂量硫磺熏蒸对党参多糖、5-HMF、党参炔苷等化学成分的影响及硫熏党参饮片不同贮藏期化学成分变化，为党参饮片的科学炮制、合理应用及质量评价提供参考。
1 材料
LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津)；色谱柱：Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 µm)；UV-2550 紫外分光光度计(日本岛津)；AUW-120D 电子天平(日本岛津)；RE-2000A 旋转蒸发仪(上海亚荣)；SK8300G超声波清洗器(上海科导)。
葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号为110833-201205，供含量测定用)；5-HMF、党参炔苷(重庆高仁生物科技有限公司，HPLC≥98%)；乙腈为色谱纯；水为双蒸水；其他试剂为分析纯。
党参药材产于重庆市巫山县，经重庆医科大学中医药学院何先元教授鉴定为中国药典2015年版一部川党参Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根。
2 方法与结果
2.1 党参多糖含量测定[8]306
2.1.1 对照品溶液的制备 取葡萄糖对照品适量，精密称定，加水溶解并制成0.3 mg·mL-1的溶液，即得。
2.1.2 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，各置 10 mL 具塞刻度试管中，分别精密加水1.9，1.8，1.7，1.6，1.5，1.4 mL，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至 10 mL，混匀后置沸水浴中保温10 min，取出，立即置冰水浴中冷却10 min，取出，以试剂为空白，在582 nm波长处测定吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，含量(M)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程A=3.318 4M+0.080 3(r=0.998 5)，结果表明，葡萄糖在0.035～0.210 mg内线性关系良好。
2.1.3 供试品溶液的制备 取党参药材细粉约0.2 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加 80%乙醇150 mL，置水浴中加热回流1 h，趁热滤过，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，将残渣及滤纸置烧瓶中，加水150 mL，置沸水浴中加热回流1 h，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤4次，每次 10 mL，合并滤液与洗液，放冷，转移至250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，按“2.1.2”项下方法测定吸光度，计算，即得。
2.1.4 方法学考察 取对照品溶液测定 6次，进行精密度考察；取供试品溶液，分别于 0，0.5，1.0，2.0，4.0 h测定，进行稳定性考察；另取党参药材细粉约0.2 g，共6份，按“2.1.3”项下方法制备并测定，进行重复性考察；再取党参药材细粉约0.1 g，共6份，分别精密加入一定量的葡萄糖对照品，按“2.1.3”项下方法测定，进行加样回收率考察。结果表明，精密度、稳定性、重复性、加样回收率测定结果的RSD值均≤3.0%；样品溶液多糖平均含量为315.16 mg·g-1，4 h内测定稳定，平均加样回收率为95.26%。
2.2 5-HMF含量测定[19]
2.2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 µm)；流动相为乙腈-0.3%醋酸溶液(3∶97)；流速为1 mL·min-1；检测波长为284 nm；温度为30 ℃；进样量为10 μL。理论板数按5-HMF峰计算应≥2 500。在此色谱条件下，5-HMF的HPLC色谱图见图1。
图1 党参HPLC图
A-5-羟甲基糠醛对照品；B-党参药材。
Fig. 1 HPLC diagrams of Codonopsis Radix
A-5-hydroxymethylfurfural; B-Codonopsis Radix.
2.2.2 标准曲线 取5-HMF对照品适量，精密称定，加水溶解并制成0.25 mg·mL-1的溶液。精密吸取对照品溶液2，4，8，10，15，20 µL，进样，以峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=623.119 4X-11.040 6(r=0.999 8)，5-HMF 在 0.52～5.2 µg 内与峰面积呈良好线性关系。
2.2.3 供试品溶液的制备 取党参药材粉末约20 g，精密称定，用水200 mL加热提取3次，时间分别为 1，0.5，0.5 h，合并提取液，浓缩，加入乙醇，使含醇量为 80%，静置过夜，滤过，滤液回收乙醇，加水至25 mL，用水饱和正丁醇萃取4次(每次30 mL)，合并正丁醇液，水浴挥干，残渣加水使溶解，转移至100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 µm)滤过，即得。
2.2.4 方法学考察 取对照品溶液进样，测定 6次，进行精密度考察；取供试品溶液，分别于0，1，2，4，8 h测定，进行稳定性考察；另取党参药材粉末约20 g，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，考察重复性；再取党参药材粉末约10 g，共6份，分别精密加入一定量的5-HMF对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，考察加样回收率。结果，精密度、稳定性、重复性、加样回收率测定结果的RSD值均≤3.0%；样品溶液5-HMF平均含量为297.33 μg·g-1，8 h内稳定性良好，平均加样回收率为101.35%。
2.3 党参炔苷含量测定[20]
2.3.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 µm)；流动相为乙腈-水(22∶78)；流速为1 mL·min-1；检测波长为267 nm；温度为25 ℃；进样量为10 µL。理论板数按党参炔苷峰计算应≥3 000。在此色谱条件下，党参炔苷色谱图见图2。
图2 党参HPLC图
A-党参炔苷对照品；B-党参药材。
Fig. 2 HPLC diagrams of Codonopsis Radix
A-lobetyolin; B-Codonopsis Radix.
2.3.2 标准曲线 取党参炔苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成50 µg·mL-1的溶液。精密吸取对照品溶液 2，4，8，10，15，20 μL，进样，以峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=510.117X-10.006 3(r=0.999 8)，党参炔苷进样量在 0.104～1.04 µg 内与峰面积成良好线性关系。
2.3.3 供试品溶液的制备 取党参药材粉末1.0 g，精密称定，精密加入甲醇50 mL，水浴回流提取30 min，精密量取提取液25 mL，挥干，残渣加甲醇溶解并稀释至5 mL，进样10 µL，测定峰面积，计算，即得。
2.3.4 方法学考察 取对照品溶液进样，测定 6次，进行精密度考察；取供试品溶液，分别于0，1，2，4，8 h测定，进行稳定性考察；另取党参药材粉末1.0 g，共6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，考察重复性；再取党参药材粉末0.5 g，共6份，分别精密加入一定量的党参炔苷对照品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，考察加样回收率。结果，精密度、稳定性、重复性、加样回收率测定结果的RSD值均≤3.0%；样品溶液党参炔苷平均含量为0.76 mg·g-1，8 h内测定稳定，平均加样回收率为97.60%。
2.4 硫熏党参样品的制备
取党参药材适量，共 5份，在密闭条件下，分别以0%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%的硫磺熏蒸24 h后，取样测定党参多糖、5-HMF、党参炔苷的含量(0月)；并分别贮藏3，6，9，12个月取样，测定上述化学成分的含量。
2.5 硫熏党参化学成分的考察
不同的硫熏党参样品于0，3，6，9，12个月测定党参多糖、5-HMF、党参炔苷的含量。结果表明，硫熏党参对多糖含量影响较小，最高剂量(2.0%)硫熏，党参多糖含量降低 1.46%，放置 12个月后，降低5.83%。硫熏对5-HMF含量影响较大，最高剂量(2.0%)硫熏，5-HMF含量增加5.76%，放置12个月后，5-HMF含量增加83.27%。硫熏对党参炔苷含量影响亦较大，最高剂量(2.0%)硫磺熏蒸，党参炔苷含量降低15.22%，放置12个月后，党参炔苷含量降低 54.09%。统计学处理表明，党参硫熏并储存12个月，其多糖含量无显著性差异，5-HMF及党参炔苷含量有极显著性差异(P＜0.01)。结果见表1。
3 讨论
硫磺熏蒸党参作为一种传统的中药材养护方法，熏后中药材及饮片外观漂亮、色泽鲜艳，而且具有防虫蛀、防腐的功效。但硫磺熏蒸对党参有效成分有显著影响，虽然测定结果显示硫磺熏蒸对党参多糖的影响较小，但多糖测定的原理是样品在酸性条件下脱水生成糖醛或其衍生物，再与特异性显色剂蒽酮反应生成稳定的有色物质，所以虽然党参多糖总量无明显改变，但部分多糖实际已转化生成糖醛或其衍生物，这与硫磺熏蒸后5-HMF含量显著增加的测定结果相吻合。原因可能是药材硫熏时SO2进入药材内部与水分接触，反应生成亚硫酸(H2SO3)而显弱酸性，在酸性条件下多糖脱水生成糖醛或其衍生物，且随药材贮藏期的延长，生成的糖醛或其衍生物蓄积增多。另外，硫磺熏蒸对党参炔苷的含量有显著影响，且随药材贮藏期的延长，影响越大。这可能与苷类成分在酸性条件下易水解，且炔苷所含炔键不稳定有关。研究结果表明，药材放置12个月，0.5%剂量硫熏党参的5-HMF含量增加31.95%，而2.0%剂量硫熏者增加83.27%，后者为前者2.5倍以上；党参炔苷含量前者降低17.07%，后者降低54.09%，后者为前者的3倍以上。
表1 不同剂量硫熏党参化学成分含量考察结果
Tab. 1 Determination of chemical constituents in Codonopsis Radix fumigated in different sulfur dosage
硫磺熏蒸药材不但对有效成分有显著影响，并且显著增加了残留 SO2的含量。服用硫磺熏蒸的中药材及饮片，短时易对肠胃、呼吸系统黏膜造成刺激，长期或大剂量服用可能对消化系统、神经系统造成损害。因此，应严格控制药材加工处理及炮制过程中硫磺的使用，确保中药材及饮片的质量，从而保证中药临床使用的有效性及安全性。
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