鹿茸为鹿科动物梅花鹿Cervus nippon或马鹿Cervus elaphus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]。鹿茸作为传统中药已经有2 000多年历史，被视为加强肾功能、性功能，延长寿命和抗衰老的补品。鹿茸具有广泛的药理作用[2-4]，但其药效成分还没有十分明确，缺少梅花鹿鹿茸和马鹿鹿茸中化学成分的系统比较，导致在加工、质量评定、真伪鉴别等工作中，缺少以化学成分作为指标的科学标准，制约了鹿茸的深入开发与利用。
目前市场上流通的鹿茸按药典规定分为梅花鹿鹿茸和马鹿鹿茸，在主要产地和主流市场均能见到2种鹿茸的销售，建立全面、系统地控制鹿茸质量的分析方法，比较二者的成分差异十分必要。鹿茸中主要含有脂类、多糖、多胺、蛋白质及多肽、激素样物质、生物碱基等多种化学成分[5-9]。鹿茸中核苷类成分是主要研究的抗衰老成分之一，主要包括尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷等。鹿茸中的次黄嘌呤、对羟基苯甲醛和磷脂会抑制与神经系统老化有关的单胺氧化酶的活性[10]。核苷类物质具有调节免疫功能、促进肠道修复、降血压、抗心律失常、抗缺血性损伤、保肝、镇静等生物活性[11-12]，与鹿茸的生物活性具有一定关联性，可作为鹿茸药材的质量评价指标之一。综上所述，本研究采用HPLC对吉林、辽宁、黑龙江等15个产地的30批梅花鹿鹿茸和马鹿鹿茸样品以尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷和肌苷5种核苷成分为指标，比较二者的含量差异，为筛选优良种质资源、规范养殖和制订质量标准提供理论依据。
1 仪器与试剂
LC-2030型高效液相色谱仪(日本岛津)；DZF-6050型电热恒温真空干燥箱(上海博讯实业有限公司)；5920R低速离心机(德国Eppendorf艾本德股份公司)；MS204S型分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。
尿嘧啶、肌苷对照品(批号为140669-201305，100469-201302)均购于中国食品药品检定研究院，纯度均≥99.6%；次黄嘌呤、尿苷、鸟苷对照品(批号为B20211，B20907，B20905)均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%。
梅花鹿鹿茸和马鹿鹿茸药材采集于吉林省长春市双阳县等地，15个产地随机采集当地的养殖大户，每份样品由长春中医药大学药学院姜大成教授鉴定为鹿科动物梅花鹿 Cervus nippon和马鹿Cervus elaphus雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
采用Aglient Eclipse Plus C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以甲醇(A)-0.07%冰醋酸溶液(B)(96∶4)为流动相，检测波长为 254 nm，流速为1.0 mL·min-1，柱温为28 ℃。在该色谱条件下，理论板数以次黄嘌呤计≥10 000，分离度＞1.5。混合对照品溶液和供试品溶液色谱图见图1。
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、鸟苷和肌苷对照品各5 mg，置于50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，然后各精密量取 1 mL，置于同一 10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，配制成0.01 mg·mL-1的溶液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过，取续滤液作为混合对照品溶液。
图1 高效液相色谱图
A-混合对照品溶液；B-第10批梅花鹿鹿茸样品；C-第23批马鹿鹿茸样品；1-尿嘧啶；2-次黄嘌呤；3-尿苷；4-肌苷；5-鸟苷。
Fig. 1 HPLC chromatograms
A-mixed reference; B-sample of Cervus nippon(batch No.10); C-sample of Cervus elaphus(batch No.23); 1-uracil; 2-hypoxanthine; 3-uridine;4-guanosine; 5-inosine.
2.3 供试品溶液的制备
精密称取干燥的鹿茸细粉(过三号筛)0.5 g，置50 mL具塞锥形瓶中，加水7.5 mL，振荡提取30 min后，离心10 min(10 000 r·min-1)，残渣再同法处理2次，合并3次离心液，离心后，离心液置于50 mL量瓶中，水定容至刻度，再用0.45 μm滤膜过滤，即得。
2.4 线性关系考察
精密量取“2.2”项下混合对照品储备液0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得不同浓度的系列混合对照品溶液。分别进样5 μL，连续进样3次。以各对照品的质量浓度(X)为横坐标，相应的峰面积积分值(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程见表1。5种核苷类成分在各自的浓度范围内具有良好的线性关系。
表1 鹿茸中5个核苷类成分的标准曲线方程、相关系数和线性范围
Tab. 1 Regression equations, correlation cofficients and linear ranges of 5 nucleosides in pilose antler
成分 标准曲线方程 r 线性范围/μg·mL-1
2.5 仪器精密度试验
精密量取混合对照品溶液5 μL，连续进样6次，测定峰面积值，计算尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷峰面积的 RSD分别为 0.06%，0.06%，0.08%，0.09%，0.09%，表明仪器精密度良好。
2.6 重复性实验
取同一批鹿茸药材样品0.5 g，按“2.3”项下方法制备5份，每个样品按“2.1”项下色谱条件连续进3针，各5 μL，进行含量测定。结果显示尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷含量的 RSD分别为0.65%，0.45%，0.72%，1.13%，0.87%，表明此法重复性良好。
2.7 稳定性试验
取鹿茸供试品溶液 5 μL，按“2.1”项下色谱条件注入液相色谱分别于0，2，6，8，12，14 h 进样3次，考察稳定性。尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的RSD分别为0.09%，0.30%，0.21%，0.18%，0.31%，结果供试品溶液中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷在14 h内峰面积无明显变化，稳定性良好。
2.8 加样回收率试验
取已知含量(尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的质量分数分别为(0.588 9，0.612 5，0.597 1，0.331 6，0.409 5 mg·g-1)的鹿茸样品约0.50 g，共9份，精密称定，按照低、中、高浓度精密加入一定量对照品溶液，制成加标样品各3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率，结果见表2。试验结果表明加样回收率良好。
2.9 含量测定
按“2.3”项下方法制备30批样品的供试品溶液，平行3份，按“2.1”项下色谱条件进样测定鹿茸中5种核苷类化合物的含量，结果见表3。
表2 鹿茸中5个核苷类成分的加样回收率
Tab. 2 Recovery rate investigation of 5 nucleosides in pilose antler
成分称样量/g样品中含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均值/%RSD/%0.500 2 0.294 6 0.235 7 0.529 7 99.75尿嘧啶0.500 1 0.294 5 0.235 7 0.532 6 101.02 0.500 2 0.294 6 0.235 7 0.529 9 99.83 0.500 0 0.294 5 0.294 5 0.588 1 99.69 0.499 8 0.294 3 0.294 5 0.592 9 101.39 0.500 2 0.294 6 0.294 5 0.594 1 101.70 0.500 1 0.294 5 0.353 4 0.658 7 103.06 0.499 9 0.294 4 0.353 4 0.660 7 103.65 0.500 1 0.294 5 0.353 4 0.650 9 100.85 101.21 1.40 0.500 2 0.306 4 0.245 1 0.550 7 99.67次黄嘌呤0.500 1 0.306 3 0.245 1 0.551 4 100.00 0.500 2 0.306 4 0.245 1 0.559 5 103.26 0.500 0 0.306 3 0.306 3 0.608 1 98.53 0.499 8 0.306 1 0.306 3 0.616 2 101.24 0.500 2 0.306 4 0.306 3 0.610 4 99.25 0.500 1 0.306 3 0.367 6 0.665 7 97.77 0.499 9 0.306 2 0.367 6 0.670 0 98.97 0.500 1 0.306 3 0.367 6 0.678 2 101.17 99.98 1.67 0.500 2 0.298 7 0.238 9 0.532 4 97.82尿苷0.500 1 0.298 6 0.238 9 0.534 9 98.91 0.500 2 0.298 7 0.238 9 0.536 1 99.37 0.500 0 0.298 6 0.298 6 0.596 4 99.73 0.499 8 0.298 4 0.298 6 0.602 4 101.81 0.500 2 0.298 7 0.298 6 0.598 5 100.40 0.500 1 0.298 6 0.358 3 0.656 3 99.83 0.499 9 0.298 5 0.358 3 0.656 4 99.89 0.500 1 0.298 6 0.358 3 0.652 8 98.86 99.63 1.12 0.500 2 0.165 9 0.132 7 0.301 7 102.34肌苷0.500 1 0.165 8 0.132 7 0.304 9 104.82 0.500 2 0.165 9 0.132 7 0.300 1 101.13 0.500 0 0.165 8 0.165 8 0.331 2 99.76 0.499 8 0.165 7 0.165 8 0.332 0 100.30 0.500 2 0.165 9 0.165 8 0.332 9 100.72 0.500 1 0.165 8 0.199 0 0.363 5 99.35 0.499 9 0.165 8 0.199 0 0.367 5 101.36 0.500 1 0.165 8 0.199 0 0.363 4 99.30 101.01 1.72 0.500 2 0.204 8 0.163 9 0.367 1 99.02鸟苷0.500 1 0.204 8 0.163 9 0.367 9 99.51 0.500 2 0.204 8 0.163 9 0.367 6 99.33 0.500 0 0.204 8 0.204 8 0.409 7 100.05 0.499 8 0.204 7 0.204 8 0.409 9 100.20 0.500 2 0.204 8 0.204 8 0.408 2 99.32 0.500 1 0.204 8 0.245 7 0.445 9 98.13 0.499 9 0.204 7 0.245 7 0.447 8 98.94 0.5001 0.204 8 0.245 7 0.447 5 98.78 99.25 0.64
表3 梅花鹿、马鹿鹿茸中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷、鸟苷的质量分数(n=3)
Tab. 3 Amount of uracil, hypoxanthine and uridine, guanosine and inosine in pilose antler of Cervus nippon and Cervus elaphus(n=3) mg·g-1
批次 采集地点 商品规格 尿嘧啶 次黄嘌呤 尿苷 肌苷 鸟苷 5种核苷总和S1 黑龙江七台河 梅花鹿 0.569 5±0.000 3 0.590 7±0.000 2 0.588 3±0.002 4 0.302 2±0.000 3 0.409 6±0.000 6 2.460 3±0.001 7 S2 黑龙江大庆 梅花鹿 0.578 9±0.000 7 0.580 4±0.002 3 0.566 3±0.000 8 0.332 3±0.004 1 0.410 0±0.001 9 2.467 9±0.001 8 S3 黑龙江伊春 梅花鹿 0.568 4±0.000 9 0.590 7±0.002 5 0.576 9±0.001 6 0.330 4±0.003 8 0.408 9±0.001 3 2.475 3±0.001 6 S4 吉林东丰 梅花鹿 0.588 6±0.005 3 0.613 2±0.009 3 0.595 3±0.010 5 0.330 7±0.007 8 0.409 7±0.007 9 2.537 5±0.019 3 S5 吉林敦化 梅花鹿 0.571 6±0.003 5 0.590 4±0.004 2 0.584 2±0.004 5 0.334 3±0.003 2 0.414 3±0.003 9 2.464 7±0.005 9 S6 吉林双阳 梅花鹿 0.608 7±0.008 8 0.624 1±0.013 5 0.608 0±0.015 0 0.335 8±0.011 0 0.416 6±0.011 8 2.593 2±0.030 8 S7 吉林白山 梅花鹿 0.588 8±0.000 2 0.612 3±0.000 2 0.592 6±0.000 9 0.332 1±0.008 0 0.403 9±0.000 4 2.529 7±0.006 9 S8 吉林永吉 梅花鹿 0.575 0±0.000 1 0.603 1±0.000 8 0.601 9±0.007 3 0.315 7±0.003 8 0.403 7±0.001 3 2.499 3±0.011 8 S9 吉林四平 梅花鹿 0.544 1±0.000 2 0.574 7±0.000 6 0.562 0±0.008 2 0.293 1±0.004 2 0.409 5±0.001 8 2.383 5±0.006 7 S10 辽宁西丰 梅花鹿 0.574 6±0.000 4 0.603 9±0.004 4 0.544 7±0.000 9 0.331 1±0.000 6 0.407 9±0.004 1 2.462 2±0.004 7 S11 河南南阳 梅花鹿 0.555 2±0.004 1 0.581 0±0.003 3 0.551 3±0.000 3 0.317 5±0.000 2 0.410 0±0.002 2 2.415 0±0.001 3 S12 四川凉川 梅花鹿 0.527 3±0.004 3 0.568 8±0.000 5 0.532 7±0.000 6 0.319 9±0.000 4 0.401 3±0.000 6 2.350 1±0.000 6 S13 新疆 梅花鹿 0.516 6±0.000 6 0.578 5±0.000 6 0.522 8±0.000 3 0.304 1±0.003 1 0.397 6±0.000 6 2.319 7±0.003 9 S14 内蒙古呼伦贝尔 梅花鹿 0.503 4±0.000 8 0.539 6±0.000 3 0.542 5±0.000 8 0.310 7±0.001 1 0.401 5±0.001 2 2.297 7±0.010 5 S15 甘肃 梅花鹿 0.504 8±0.002 3 0.579 4±0.000 3 0.542 0±0.000 1 0.293 4±0.001 1 0.398 4±0.001 1 2.318 0±0.003 8 S16 辽宁本溪 马鹿 0.452 8±0.003 8 0.173 5±0.001 6 0.389 0±0.009 2 0.266 2±0.009 3 0.382 2±0.009 3 1.663 8±0.009 2 S17 辽宁抚顺 马鹿 0.458 2±0.005 3 0.184 0±0.002 7 0.330 7±0.001 1 0.279 3±0.002 8 0.378 5±0.002 8 1.630 6±0.005 3 S18 安徽 马鹿 0.431 3±0.002 6 0.158 5±0.001 2 0.336 8±0.008 2 0.319 1±0.002 9 0.394 5±0.002 9 1.640 2±0.001 7 S19 新西兰 马鹿 0.482 8±0.000 8 0.203 5±0.001 4 0.359 0±0.000 4 0.323 3±0.001 9 0.397 4±0.009 8 1.756 0±0.007 9 S20 黑龙江 马鹿 0.453 6±0.003 1 0.238 3±0.002 4 0.382 3±0.000 9 0.295 1±0.002 6 0.377 7±0.002 6 1.747 1±0.008 7 S21 内蒙古 马鹿 0.484 8±0.002 2 0.133 0±0.003 0 0.398 2±0.001 6 0.332 2±0.003 4 0.387 9±0.003 1 1.736 1±0.006 2 S22 山西 马鹿 0.438 9±0.003 2 0.197 8±0.004 3 0.325 0±0.005 9 0.287 8±0.001 5 0.377 2±0.001 4 1.626 7±0.004 4 S23 吉林 马鹿 0.488 6±0.000 8 0.178 6±0.002 1 0.356 7±0.007 4 0.289 9±0.004 9 0.369 4±0.004 8 1.683 4±0.006 1 S24 北京 马鹿 0.467 4±0.000 4 0.143 8±0.001 4 0.332 3±0.007 3 0.296 8±0.000 3 0.382 4±0.002 7 1.622 8±0.005 0 S25 甘肃 马鹿 0.453 0±0.000 6 0.180 4±0.001 0 0.335 7±0.001 1 0.297 2±0.004 9 0.368 6±0.007 5 1.634 9±0.006 9 S26 青海 马鹿 0.478 2±0.003 0 0.151 7±0.002 3 0.389 6±0.001 5 0.304 1±0.006 6 0.368 1±0.001 2 1.691 8±0.003 7 S27 新疆天山 马鹿 0.493 0±0.001 7 0.184 6±0.001 2 0.375 3±0.007 3 0.313 4±0.002 1 0.371 0±0.003 9 1.737 3±0.004 1 S28 新疆塔里木 马鹿 0.497 5±0.008 1 0.198 4±0.002 6 0.381 8±0.004 5 0.296 4±0.004 0 0.397 3±0.006 6 1.771 3±0.001 8 S29 四川 马鹿 0.463 0±0.002 8 0.132 4±0.008 2 0.375 5±0.004 7 0.290 7±0.003 8 0.366 9±0.003 7 1.628 5±0.009 3 S30 浙江 马鹿 0.450 5±0.004 2 0.189 3±0.004 4 0.382 2±0.002 1 0.296 0±0.008 1 0.378 2±0.008 3 1.696 2±0.003 4
2.1 0 聚类分析
分别取梅花鹿、马鹿鹿茸中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、肌苷和鸟苷的含量测定结果进行聚类分析。采用 SPSS 19.0统计软件的 Ward法，选取平方Euclidean距离作为样品度量标准，对30批样品进行系统聚类分析，绘出树状图，结果见图2。
根据聚类分析结果，将30批样品分为2类：第1类有15批药材，即S1～S15；此类药材中5种核苷含量均大于均值，因此总含量大于平均值，其中 S6 5种核苷含量及总含量大于其他批次；第 2类有15批药材，即S16～S30，此类药材中5种核苷含量均小于均值，因此总含量小于平均值。
图2 HPLC同时测定鹿茸中5 种核苷类成分的聚类分析
Fig. 2 Dendrogram of HPLC method for simultaneous determination of 5 kinds of nucleosides in pilose antler
3 讨论
核苷类成分具有抗衰老，增强免疫等活性，它们是鹿茸中主要活性成分之一。本实验结果表明，梅花鹿鹿茸中5种核苷类成分的质量分数总和总体上是高于马鹿鹿茸，这可能和马鹿鹿茸体积较大，骨化程度大有关系。不同产地的梅花鹿鹿茸，吉林、黑龙江地区梅花鹿鹿茸的核苷类成分略高一些。这可能和梅花鹿的养殖技术、养殖环境有关系，东北是梅花鹿养殖的主要产区，其鹿茸产量占全国鹿茸产量的60%以上。目前市场上鹿茸药材也以梅花鹿鹿茸为主。本实验的研究结果也显示，就核苷类成分而言，其含量结果也验证了梅花鹿的鹿茸质量优于马鹿鹿茸。在以后的研究中，笔者会深入全面地研究二者的成分差异，为梅花鹿和马鹿的养殖，鹿茸的经济价值提升提供更深入的理论依据。
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