中药注射剂从我国传统煎剂长期临床用药的基础上发展而来，突破了传统给药方式，是传统中医药理论与现代生产工艺相结合的产物。中药注射液起效迅速、作用强，被广泛开发并应用于临床，但由于其成分复杂、不良反应多，其安全性一直是药品安全性评价中的热点问题[1-2]。
舒肝宁注射液是一种用于治疗急、慢性病毒性肝炎的纯中药复方注射制剂，由茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物、灵芝提取物精制而成，具有清热解毒、利湿退黄、益气扶正和保肝护肝的功效，可有效消除临床症状和体征[3-6]。在临床使用过程中，舒肝宁注射液的不良反应发生率较高，轻者为皮疹、瘙痒、畏寒、发热，严重的可导致过敏性休克[7-8]。目前，关于舒肝宁注射液稳定性的研究很少，而已有的文献仅考察了其配伍后的不溶性微粒[9]。
本实验通过对临床上常用的不同浓度舒肝宁注射液配制后性状、pH值、不溶性微粒、有效成分(绿原酸、栀子苷、黄芩苷)稳定性的考察，为提高舒肝宁注射液的稳定性和临床合理用药提供参考。
1 仪器与试剂
Waters 2695高效液相色谱色谱仪，配有2487双通道紫外可见检测器(Waters公司)；AB204-S型十万分之一天平(瑞士Mettler Toledo)；FE20实验室pH计(梅特勒-托利多仪器有限公司)；GWF-8JD微粒分析仪(天津天河分析仪器有限公司)；102CR电热鼓风干燥箱(山东潍坊精鹰医疗器械公司)；XW-80A型旋涡混合器(上海精科实业有限公司)。
对照品绿原酸(批号：LYS2015041901)、栀子苷(批号：ZZG2016052501)、黄芩苷(批号：HQG2016031211)均购自南京春秋生物工程有限公司，纯度均＞98%；舒肝宁注射液(贵州瑞和制药有限公司，批号：20160901，20160905，20161024，规格：每支2 mL)；茵陈提取物和栀子提取物购自南京道斯夫生物科技有限公司；板蓝根提取物和灵芝提取物购自天瑞生物科技有限公司；甲醇为色谱纯[赛默飞世尔(中国)有限公司]；磷酸为分析纯(石家庄黄磷厂)；水为纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。
2 方法与结果
2.1 溶液配制方法
舒肝宁注射液说明书用法用量规定：每次10～20 mL，用10%葡萄糖注射液250～500 mL稀释后静脉滴注。根据临床常用剂量，考察2种浓度[低浓度(10 mL舒肝宁注射液配伍10%葡萄糖注射液250 mL)、高浓度(20 mL舒肝宁注射液配伍10%葡萄糖注射液 250 mL)]的稳定性。所有成品溶液均在静脉集中配制中心百级洁净台配制。配制后的成品溶液分别放置于室温、光照(4 500 Lx)、40 ℃恒温环境下，测定不同时间点的不溶性微粒、pH值、有效成分(绿原酸、栀子苷、黄芩苷)的含量。
2.2 成品输液相关指标考察
性状：观察室温、光照、40 ℃恒温条件下0，1，2，4，8，12，24 h时各成品输液的澄明度和色泽。
pH：参照中国药典 2015年版四部通则0631[10]，测定室温、光照、40 ℃恒温条件下0，1，2，4，8，12，24 h各成品输液的pH值。
不溶性微粒：依照中国药典2015年版四部通则0903[10]，测定室温、光照、40 ℃恒温条件下0，1，2，4，8，12，24 h各成品输液的不溶性微粒数，每个样品测3次，求其平均值。
2.3 绿原酸、栀子苷、黄芩苷含量测定方法
2.3.1 色谱条件 采用 Symmetry® C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为甲醇(A)-0.4%磷酸水溶液(B)。梯度洗脱(0～23 min，25%→75%A)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：238 nm。进样量：10 μL。在上述色谱条件下，对照品和样品色谱图见图1。
图1 高效液相色谱图
A-对照品；B-供试品；1-绿原酸；2-栀子苷；3-黄芩苷。
Fig. 1 HPLC chromatograms
A-reference standard; B-sample; 1-chlorogenic acid; 2-geniposide;3-baicalin.
2.3.2 溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称定绿原酸、栀子苷、黄芩苷对照品，加适量甲醇制成对照品储备溶液(绿原酸、栀子苷、黄芩苷浓度分别为 1.100，1.200，1.600 mg·mL-1)。分别取已配好的绿原酸、栀子苷、黄芩苷储备液适量，加入甲醇配制成备用的混合对照品溶液(绿原酸、栀子苷、黄芩苷浓度分别为 22.00，150.0，800.0 μg·mL-1)，涡旋 2 min，备用。
供试品溶液的制备：取配制好的舒肝宁注射液成品500 μL，加500 μL甲醇稀释，涡旋2 min。用0.22 µm微孔滤膜过滤，取澄清的续滤液作为供试品溶液，进样测定。
阴性对照溶液的制备：取茵陈提取物、栀子提取物、黄芩苷、板蓝根提取物、灵芝提取物适量，按其处方比例和工艺，制备缺少茵陈、栀子、黄芩苷的阴性对照溶液。
2.3.3 方法学考察 专属性试验：取阴性对照溶液按“2.3.1”项下色谱条件进样，结果见图2，在与绿原酸、栀子苷、黄芩苷对照品色谱相应的位置上无峰，表明阴性对照对试验无干扰。
图2 阴性对照样品色谱图
A-缺茵陈阴性样品；B-缺栀子阴性样品；C-缺黄芩苷阴性样品；1-绿原酸；2-栀子苷；3-黄芩苷。
Fig. 2 HPLC chromatograph of negative control sample
A-negative control without Artemisiae Scopariae Herba; B-negative control without Gardeniae Fructus; C-negative control without baicalin;1-chlorogenic acid; 2-geniposide; 3-baicalin.
线性范围考察：精密量取绿原酸、栀子苷、黄芩苷混合对照品溶液适量，用甲醇逐级稀释，制得 7个不同浓度梯度的标准溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分析测定，记录峰面积。以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X)为横坐标，制作绿原酸、栀子苷、黄芩苷的标准曲线。得绿原酸的回归方程为Y=22 502X-545.73(r=0.999 9)，栀子苷为Y=16 597X+4 109.6(r=0.999 9)，黄芩苷为 Y=16 944X+6 130.2(r=1.000)，表明绿原酸、栀子苷、黄芩苷分别在质量浓度为 0.343 8～22.00 μg·mL-1、2.344～150.0 μg·mL-1、12.50～800.0 μg·mL-1内线性关系良好。
定量限与检测限：将混合对照品溶液适当稀释，得系列不同浓度混合对照品溶液，分别进样分析，按信噪比(S/N)=3对应浓度为检测限，S/N=10对应浓度为定量限，测得绿原酸、栀子苷、黄芩苷检测限分别为 0.086 0，0.293 0，0.500 0 μg·mL-1；绿原酸、栀子苷、黄芩苷定量限分别为 0.171 9，0.586 0，1.250 μg·mL-1。
仪器精密度试验：取同一浓度的混合对照品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件重复进样 6次，测定峰面积，并计算峰浓度。绿原酸、栀子苷、黄芩苷的峰面积 RSD分别为 1.53%，1.69%，2.03%，结果均符合要求，仪器精密度良好。
重复性试验：取同一批号样品，按“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法平行制备 6份供试品溶液，按“2.3.1”项下色谱条件分别进样测定分析，并计算 3个成分的含量。绿原酸、栀子苷、黄芩苷的RSD分别为1.26%，2.11%，1.70%，结果均符合规定，表明该方法重复性良好。
回收率试验：精密量取已知含量的样品250 μL(批号：20160901)6 份(含绿原酸 0.401 8 μg、栀子苷 5.891 μg、黄芩苷 186.1 μg)，分别精密加入对照溶液(含绿原酸 0.423 1 μg、栀子苷 6.000 μg、黄芩苷181.8 μg)，摇匀。制备成供试品溶液后进样测定，记录结果，并计算回收率，结果测得绿原酸、栀子苷、黄芩苷平均回收率分别为97.59%，97.90%，98.51%，RDS分别为 2.03%，1.90%，1.73%。结果表明，该方法的回收率良好。
2.4 各指标考察结果
2.4.1 性状 所有成品输液均为澄明液体，且色泽在24 h内无明显变化。
2.4.2 pH值 低浓度和高浓度成品输液在室温、光照、40 ℃恒温条件放置过程中，可以看出在40 ℃恒温时低浓度和高浓度供试品随着时间的延长，pH值有所下降；室温对pH值的影响较小。结果见图3。
图3 舒肝宁注射液各成品输液0～24 h pH值趋势图
Fig. 3 Tendency of pH value of Shuganning injection during 0-24 h
2.4.3 不溶性微粒 中国药典2015年版规定：标示装量为100 mL或以上的静脉注射液，除另有规定外，每1 mL中粒径为10 μm或以上的微粒不得超过25个，粒径为25 μm或以上的微粒不得超过3个。在室温、光照和40 ℃条件下，低、高浓度成品液在24 h内不溶性微粒数没有超过药典的规定，符合药典要求。结果见表1。
2.4.4 绿原酸、栀子苷、黄芩苷含量 分别取在室温、光照、40 ℃恒温条件下 0，1，2，4，8，12，24 h时的舒肝宁注射液成品液适量，按“2.3.1”项下色谱条件进样分析测定，记录绿原酸、栀子苷、黄芩苷色谱峰面积，代入相应的标准曲线，分别计算绿原酸、栀子苷、黄芩苷含量。舒肝宁注射液低浓度和高浓度配置后溶液在24 h内放置的过程中绿原酸、栀子苷、黄芩苷含量均有所下降。40 ℃恒温对3种成分的影响大于光照条件和室温。3个成分中黄芩苷放置过程中含量下降的比绿原酸和栀子苷较多。结果见表2～3。
表1 不溶性微粒考察结果(10 μm/25 μm，n=3)
Tab. 1 Results of the insoluble particles(10 μm/25 μm,n=3) ·mL-1
高浓度室温 5/0 7/0 7/1 9/1 7/2 8/2 12/2光照 13/1 15/1 13/1 17/1 21/2 19/2 22/3 40 ℃ 6/0 8/1 8/2 10/1 9/1 13/2 17/3
表2 低浓度成品液绿原酸、栀子苷、黄芩苷的含量变化(n=3)
Tab. 2 Content changes of chlorogenic acid, geniposide and baicalin in low concentration liquid(n=3) μg·mL-1/%
浓度 放置条件 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h室温 0.802 3/100.0 0.802 5/100.1 0.806 0/100.5 0.804 0/100.2 0.801 0/99.84 0.801 4/99.89 0.795 2/99.12绿原酸 光照 0.803 0/100.0 0.799 0/99.50 0.800 4/99.68 0.794 9/98.99 0.795 8/99.11 0.797 4/99.30 0.792 8/98.73 40 ℃ 0.790 9/100.0 0.789 9/99.88 0.794 5/100.5 0.791 8/100.1 0.782 8/98.98 0.781 0/98.76 0.772 1/97.63室温 11.97/100.0 11.78/98.41 11.86/99.12 11.87/99.20 11.88/99.28 11.87/99.19 11.83/98.89栀子苷 光照 11.72/100.0 11.86/101.2 11.61/99.03 11.64/99.32 11.71/99.92 11.63/99.21 11.55/98.53 40 ℃ 11.77/100.0 11.76/99.94 11.83/100.5 11.90/101.2 11.66/99.05 11.63/98.79 11.60/98.60室温 375.8/100.0 375.5/99.92 377.6/100.5 371.7/98.91 373.5/99.39 371.3/98.80 368.1/97.95黄芩苷 光照 370.4/100.0 364.4/98.40 366.5/98.96 366.1/98.85 366.8/99.02 364.0/98.27 360.4/97.29 40 ℃ 373.4/100.0 370.2/99.15 375.6/100.6 369.7/99.01 364.4/97.59 362.4/97.05 361.5/96.82
表3 高浓度成品液绿原酸、栀子苷、黄芩苷的含量变化(n=3)
Tab. 3 Content changes of chlorogenic acid, geniposide and baicalin in high concentration liquid(n=3) μg·mL-1/%
浓度 放置条件 0 h 1 h 2 h 4 h 8 h 12 h 24 h室温 1.648/100.0 1.657/100.5 1.650/100.1 1.655/100.4 1.644/99.74 1.633/99.07 1.635/99.21绿原酸 光照 1.605/100.0 1.604/99.94 1.607/100.1 1.596/99.43 1.607/100.1 1.591/99.14 1.601/99.78 40 ℃ 1.610/100.0 1.608/99.90 1.603/99.61 1.601/99.49 1.602/99.55 1.589/98.72 1.575/97.86室温 23.40/100.0 23.44/100.2 23.26/99.39 23.27/99.46 23.26/99.38 23.22/99.21 23.20/99.16栀子苷 光照 23.67/100.0 23.66/99.94 23.64/99.85 23.67/100.0 23.61/99.75 23.54/99.47 23.39/98.80 40 ℃ 23.44/100.0 23.45/100.0 23.40/99.86 23.29/99.38 23.33/99.56 23.05/98.36 22.99/98.07室温 711.3/100.0 711.4/100.0 708.6/99.61 710.2/99.84 711.0/99.96 703.8/98.95 701.5/98.62黄芩苷 光照 697.8/100.0 696.1/99.76 698.7/100.1 696.4/99.80 688.3/98.64 684.5/98.10 681.7/97.70 40 ℃ 700.4/100.0 699.3/99.85 699.6/99.89 693.9/99.07 689.2/98.41 689.4/98.43 682.8/97.49
3 讨论
通过考察舒肝宁注射液在室温、光照和40 ℃恒温放置24 h的质量变化情况，结果可以看出舒肝宁注射液成品液的性状、颜色无明显变化。室温和光照对pH值的影响较小，40 ℃恒温时低浓度和高浓度溶液随着时间的延长，pH值略有下降。舒肝宁注射液成品液在室温、光照和40 ℃恒温条件下不溶性微粒24 h内符合药典规定，没有超限。舒肝宁注射液在室温下放置 12 h，低浓度和高浓度溶液中 3种成分绿原酸、栀子苷、黄芩苷含量变化均不大；但到 24 h时低浓度黄芩苷下降了2.05%。光照和40 ℃恒温时3种成分含量均有下降，而40 ℃恒温对其影响更大，可见配制后的成品液应避免高温和强光直射。综上所述，建议配制后的舒肝宁成品液最好在12 h内输注，超过24 h后请谨慎使用；并储存于室温条件(10～30 ℃)下，避免强光照射。
中药注射剂与溶媒配伍后所产生的不溶性微粒是人体无法代谢的，会引起静脉炎、血管栓塞、肉芽肿、肺动脉高压、输液不良反应等，对人体的存在危害严重[11]，所以建议输液药品的配制应在静脉配制中心完成，且中药注射剂的输注尽可能使用精密输液器，以减少进入人体的不溶性微粒，减少输液不良反应。
近年来临床应用中药注射液造成的不良事件时有发生，中药注射液的成品输液稳定性已成为研究热点，决定着患者的用药安全[12]。本试验通过对舒肝宁注射液配置后成品液稳定性的研究，为舒肝宁注射液的临床用药安全提供了依据。而在实际工作还应随时注意观察患者情况，减少不良反应的发生。
[1] 王梅, 刘国强, 王志峰. 中药注射剂的发展现状与分析展望[J]. 临床合理用药杂志, 2010, 3(22): 156-158.
[2] WU X R, LIN H Z, LI T, et al. Changes of insoluble particles in five kinds of traditional Chinese medicine injections mixed with infusion solution [J]. Chin Med Herald(中国医药导报),2012, 9(1): 147-148.
[3] ZHANG J, ZHANG Y P, HE F. Fingerprint chromatography of Shuganning injection by HPLC [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2015, 32(7): 824-827.
[4] ZHANG J. Protective effect of Shuganning injection against liver injury induced by cisplatin in mice [J]. China Pharm(中国药房), 2016, 27(7): 920-922.
[5] LIANG H X, LI L Q. Meta analysis in the clinical study of chronic viral hepatitis B treated with Shuganning injection [J].World J Integr Tradit West Med (世界中西医结合杂志), 2016,11(8): 1057-1066.
[6] 关妮. 舒肝宁注射液临床应用进展[J]. 医学理论与实践,2014, 27(10): 1291-1292+1295.
[7] 梁岩, 耿传信, 周学锋. 舒肝宁注射液致严重过敏反应1例[J]. 中国药物警戒, 2012, 9(1): 60.
[8] 饶双超, 陈密, 姜卫中. 舒肝宁注射液致过敏反应典型案例分析[J]. 中南药学, 2014, 12(9): 943.
[9] CAI C H. Detection of insoluble particles in 6 commonly used TCM injections before and after mixed with solvents [J]. Chin Pharm(中国药房), 2013, 24(27): 2560-2562.
[10] 中国药典. 四部[S]. 2015: 77-78, 114-115.
[11] ZHI X R, BAI W J, WANG Q M, et al. Compatibility stability of Shenkang injection [J]. Chin Pharm(中国药师), 2016,19(11): 2155-2157.
[12] ZHI X R, SONG H J, WANG M, et al. Compatibility stability of Esomeprazole Sodium for Injection [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2017, 34(12): 1727-1730.