酸枣仁皂苷A的抗血小板聚集活性研究

(1.湖北省妇幼保健院药剂科，武汉 430070；2.武汉科技大学附属天佑医院药剂科，武汉 430064；3.湖北中医药大学药学院，武汉 430065)

摘要：目的研究酸枣仁皂苷A的抗血小板聚集活性。方法采用兔体外血小板聚集实验方法，结合酶联免疫吸附法测定血清血小板活化因子(platelet activating factors，PAF)、P-选择素和血小板因子-4(platelet factor-4，PF-4)的含量，探讨不同浓度的酸枣仁皂苷A对二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid，AA)和PF-4诱导血小板聚集的抑制活性。结果酸枣仁皂苷A能有效抑制AA、ADP和PF-4诱导的血小板聚集，能显著降低PAF、P-选择素和PF-4的含量。结论酸枣仁皂苷A具有明显的抗血小板聚集活性。

血栓形成可导致急性心肌梗死、中风和肺栓塞等疾病，是外科手术中常见的并发症。血小板活化是血栓产生的重要环节，抗血小板聚集药已作为常规治疗用于心脑血管疾病。阿司匹林是目前临床上最常用的抗血小板聚集药，然而，它的不良反应也相当明显，主要为出血，少数患者有过敏反应，表现为荨麻疹和瘙痒。近年来，临床上常出现阿司匹林抵抗现象，从而使治疗效果大大降低。天然产物三萜皂苷广泛地分布于植物中，具有多种重要的生物活性和药理作用。近年来研究发现，有些三萜皂苷有良好的抗血小板聚集活性[1-5]。酸枣仁皂苷A是酸枣仁中最重要的活性分子，属于达玛烷型三萜皂苷，含有独特的五糖结构，结构式见图1。它具有镇静催眠和抗炎等生物活性，但抑制血小板聚集的活性研究尚未见报道。本研究考察酸枣仁皂苷A的抗血小板聚集作用及作用机制，为酸枣仁皂苷A的药用开发提供实验依据。

图1 酸枣仁皂苷A的结构式

Fig. 1 Structure of jujuboside A

1 材料与试剂

1.1 仪器

PL-11血小板功能分析仪(江苏英诺华医疗技术有限公司)；Multiskan GO全波酶标仪(美国Thermo公司)。

1.2 试剂

枸椽酸钠(国药集团化学试剂有限公司)；血小板活化因子(platelet activating factors，PAF，上海朗顿生物科技有限公司，批号：20170305)；花生四烯酸(arachidonic acid，AA，武汉欣欣佳丽生物科技有限公司，批号：20161203)；阿司匹林(湖北恒硕药业有限公司，批号：201701110)；酸枣仁皂苷A(批号：20170102)和二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP，批号：20170603)均购自百灵威科技有限公司；兔PAF酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(上海酶联生物有限公司，批号：20170801)；兔血小板因子-4 (platelet factor-4，PF-4，批号：170508R)与P-选择素的ELISA 试剂盒(批号：170413R)均购自美国Sigma公司。

1.3 动物

新西兰兔，♂，体质量约2 kg，购于华中科技大学实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK(鄂)-2016-0009。

2 方法

2.1 分组与给药

将健康兔按体质量随机分为5组：空白组，阿司匹林对照组，酸枣仁皂苷A低、中、高剂量组，每组10只。空白组给予等体积0.9% NaCl，酸枣仁皂苷A低、中、高剂量组分别给予酸枣仁皂苷A 4，8，16 mg·kg-1。酸枣仁皂苷A和阿司匹林(10 mg·kg-1)通过耳缘静脉给药，每日1次，连续给药1周后检测相关指标。

2.2 血小板聚集功能测定

将兔麻醉后分离颈动脉插管，取血，3.8%枸橼酸钠溶液(1∶9比例抗凝)。1 000 r·min-1离心20 min，收集上清液，得富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，剩余部分3 000 r·min-1离心15 min，收集上清液，得贫血小板血浆((platelet-poor plasma，PPP)。以PPP 稀释PRP至血小板数为(200~250)×109·L-1。依据Born氏比浊法，血小板聚集仪预热至37 ℃，300 μL PPP调零。取270 μL PRP加20 μL待测样品至测试杯中，孵育5 min后，分别加入AA(终浓度为4 μmol·L-1)、ADP (终浓度为4 μmol·L-1)、PAF(终浓度为4 μmol·L-1)诱导血小板聚集，以阿司匹林为阳性对照，考察酸枣仁皂苷A对ADP、AA和PAF诱导的血小板聚集的抑制作用。按比浊法(光学法)用血小板聚集仪测定血小板最大聚集率。

2.3 ELISA法检测大鼠血清PAF、P-选择素及PF-4含量

将收集的全血标本在室温放置2 h，以1 000 r·min-1离心20 min，取上清。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。用酶标仪读取数据结果。

2.4 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，实验数据用 width=27.1,height=13.1

表示，组间比较采用单因素方差分析检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 酸枣仁皂苷A对AA诱导体外血小板聚集的影响

与空白组比较，酸枣仁皂苷A低、中、高浓度都能极其显著地抑制AA诱导的体外血小板聚集(P<0.01)，呈剂量相关性。提示酸枣仁皂苷A有显著的体外血小板聚集抑制作用，活性明显强于阿司匹林(P<0.01)。结果见表1。

3.2 酸枣仁皂苷A对ADP诱导体外血小板聚集的影响

与空白组比较，酸枣仁皂苷A呈剂量依赖性抑制ADP诱导的家兔血小板聚集(P<0.01)，但弱于阿司匹林。结果见表1。

3.3 酸枣仁皂苷A对PAF诱导体外血小板聚集的影响

与空白组比较，酸枣仁皂苷A呈剂量依赖性抑制PAF诱导的家兔血小板聚集(P<0.01)，在高剂量时活性强于阿司匹林(P<0.01)，中剂量组同样具有统计学差异(P<0.05)。结果见表1。

表1 酸枣仁皂苷A对AA、ADP、PAF诱导下的血小板聚集的影响(n=10, width=23.4,height=11.2 )

Tab. 1 Effect of jujuboside A on the AA, ADP, PAF-induced platelet aggregation(n=10, width=23.4,height=11.2 )

注：与空白组比较，1)P<0.01；与阿司匹林组比较，2)P<0.01，3)P<0.05。

Note: Compared with blank group,1)P<0.01; compared with asprin group,2)P<0.01,3)P<0.05.

3.4 酸枣仁皂苷A对PAF、P-选择素和PF-4含量的影响

与空白组比较，酸枣仁皂苷A中、高剂量组的PAF、P-选择素和PF-4含量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.01)；酸枣仁皂苷A低剂量组能有效降低PAF、P-选择素的浓度(P<0.01)，也能有效抑制PF-4含量(P<0.05)。与阿司匹林组比较，酸枣仁皂苷A各剂量组的PAF、P-选择素含量显著降低，差异有显著的统计学差异(P<0.01)，高剂量组PF-4含量也显著降低(P<0.01)。结果见表2。

表2 酸枣仁皂苷A对PAF、P-选择素和PF-4含量的影响(n=10, width=23.4,height=11.2 )

Tab. 2 Effect of jujuboside A on the content of PAF, P-selectin, and PF-4(n=10, width=23.4,height=11.2 ) ng·L-1

注：与空白组比较，1)P<0.01，2)P<0.05；与阿司匹林组比较，3)P<0.01。

Note: Compared with blank group,1)P<0.01,2)P<0.05; compared with asprin group,3)P<0.01.

3 讨论

自然界中的多糖及糖苷具有广谱生物活性，探寻糖类化合物的生物活性及其构效关系已成为国内外糖化学和糖生物学研究的重要课题，糖药物的研发已成为新药开发的一个重要领域，肝素、透明质酸、香菇多糖、芦丁和薯蓣皂苷等天然的糖类化合物已经成功地应用于临床，取得了良好的社会效益和经济效益。肝素是临床上常用的抗血栓药物。血小板在血栓形成的过程中起着重要的作用，血小板活化是发生聚集形成血栓的重要环节，因此，抗血小板聚集活性对于减少或防止血栓形成具有重要作用。目前上市的抗血小板药物大部分都具有一定的出血风险，其临床应用受到严密监控。ADP、AA和PAF是激活血小板的3条主要途径[6]。PAF、P-选择素和PF-4是体内血小板释放的特异性因子，三者含量的增高反映血小板释放功能增强[7-10]。实验表明酸枣仁皂苷A对于AA诱导血小板聚集的抑制作用强于PAF和ADP，它可能主要通过阻断AA途径来抑制PAF合成、降低P-选择素与PF-4含量并抑制血小板的释放，从而发挥抗血小板聚集作用。有关酸枣仁皂苷A抗血小板聚集活性的构效关系和抗血小板机制还有待进一步研究与证实。有必要指出的是，血小板的聚集对凝血和止血及修补破损血管有重要意义。目前的抗血小板聚集药物的作用都是不可逆的，长时间抑制血小板聚集也是有害的，开发逆转抗血小板聚集活性的药物有良好临床应用前景。将酸枣仁皂苷A的寡糖通过水解脱除，或者将它寡糖部分的伯醇硫酸化分别获得游离皂苷元和聚阴离子衍生物的抗血小板聚集活性研究正在进行中，有待进一步报道。

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(1.Pharmaceutical department, Maternal and Child Health Care Hospital of Hubei, Wuhan 430070, China; 2.Pharmaceutical department, Tianyou Hospital affiliated to Wuhan University of Science and technology, Wuhan 430064, China; 3.School of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China)

ABSTRACT:OBJECTIVETo investigate the anti-platelet aggregation activity and mechanism of jujuboside A.METHODSThe anti-platelet aggregation activity of jujuboside A was evaluatedin vitroon rabbit platelet aggregation, and the content of platelet activating factors(PAF), P-selectin and platelet factor-4(PF-4) were detected by enzyme-linked immunosorbent assay. The inhibitory effects of jujuboside A with different concentration on platelet aggregation induced by adenosine diphosphate(ADP), arachidonic acid(AA) or PF-4 was investigated.RESULTSJujuboside A inhibited the platelet aggregation induced by AA, ADP or PF-4, and decreased the expression levels of PAF, PF-4 and P-selectin.CONCLUSIONJujuboside A can inhibit aggregation and activity of plateletin vitro.

引用本文：万蒞, 易蕾, 王红. 酸枣仁皂苷A的抗血小板聚集活性研究[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(10): 1514-1516.

作者简介：万蒞，女，硕士，副主任医师 Tel: (021)87640230 E-mail:1027949621@qq.com