高晓洁1，张水利2*
(1.浙江中医药大学附属第二医院，杭州 310005；2.浙江中医药大学药学院，杭州 310053)
摘要：目的采用HPLC测定浙产6种威灵仙类药材中齐墩果酸的含量，为扩大浙江地区威灵仙药源提供参考。方法采用Hypersil BOS C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(90∶10)，流速为0.8 mL·min-1，柱温为25 ℃，检测波长为210 nm。结果威灵仙、扬子铁线莲、粗齿铁线莲、毛蕊铁线莲、柱果铁线莲中齐墩果酸含量分别为0.381%，0.172%，0.395%，0.001 84%，1.70%，山木通中齐墩果酸含量太低无法计算。结论柱果铁线莲、粗齿铁线莲可考虑作为威灵仙的替代资源，其他品种能否作为威灵仙入药，尚有待探讨。
关键词：威灵仙类药材；齐墩果酸；高效液相色谱法；含量测定
威灵仙为我国中医临床和民间常用的祛风止痛类药物，主要含有以齐墩果酸和常春藤皂苷元为苷元的三萜皂苷等成分[1]。正品威灵仙来源于毛茛科铁线莲属植物威灵仙Clematis chinensisOsbeck、棉团铁线莲Clematis hexapetalaPall.、东北铁线莲ClematismanshuricaRupr.[2]。威灵仙资源主要以野生为主，过度的采收导致资源紧张，为缓解目前威灵仙临床用量与资源供应紧张的矛盾，在铁线莲属植物中开展威灵仙替代品的研究甚为迫切。该属植物中可作为中药威灵仙使用的品种较多，仅据《浙江药用植物志》记载就有7个品种[3]。本实验在前期研究[4]基础上筛选了浙江分布广、资源丰富的6种铁线莲属植物，采用HPLC对这6种威灵仙资源品种中的三萜皂苷元齐墩果酸进行了含量测定，为扩大威灵仙类药材资源提供依据。
LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；AR2130十万分之一天平(美国Ohaus)；AP-9801s真空泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。
齐墩果酸(中国药品生物制品检定所，批号：110709-200505；纯度：98%)；甲醇(色谱纯，天津四友精细化学品有限公司)；盐酸(分析纯，杭州化学试剂有限公司)；乙酸乙酯(分析纯，浙江杭州双林化工试剂厂)；水(纯净水)。威灵仙类药材样品经浙江中医药大学张水利教授鉴定，分别阴干，打粉，过20目筛备用。样品信息见表1。
色谱柱为Hypersil BOS C18柱(4.6 mm× 150 mm，5 μm)；流动相：甲醇-水(90∶10)；检测波长：210 nm；流速：0.8 mL·min-1；柱温：25 ℃。
表1 样品信息
Tab. 1 Sample information
2.2.1 对照品溶液的配制 精密称取减压干燥至恒重的齐墩果酸对照品5 mg，置5 mL量瓶中，甲醇溶解，定容，得浓度为l mg·mL-1的对照品溶液。
2.2.2 样品溶液的配制 分别精密称取市售威灵仙、威灵仙、扬子铁线莲、粗齿铁线莲、毛蕊铁线莲、柱果铁线莲、山木通药材粗粉各2 g(n=3)，置150 mL圆底烧瓶内，加入40 mL蒸馏水，沸水浴回流提取1 h，趁热抽滤，滤液定容至40 mL，加盐酸，使盐酸浓度为10%，沸水浴回流水解1 h。水解液用乙酸乙酯萃取(16 mL×3次)，挥干乙酸乙酯，残渣以甲醇溶解，定容至5 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液作为样品溶液。
2.3.1 线性关系考察 精密吸取对照品溶液1 mL，于2 mL离心管中，加甲醇1 mL稀释成浓度为0.5 mg·mL-1的对照品溶液，加甲醇将对照品溶液逐一对半稀释，配制成质量浓度为0.25，0.125，0.062 5，0.031 25，0.015 625 mg·mL-1的对照品溶液。分别吸取不同浓度的对照品溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。得回归方程：Y=5 862.7X+7.252 2，r=0.999 9。结果表明，齐墩果酸对照品溶液浓度在0.015 625~ 0.25 mg·mL-1内线性关系良好。
2.3.2 仪器精密度试验 精密吸取对照品溶液0.1 mL，置1 mL量瓶中，甲醇定容，连续进样6次，每次20 μL，测定峰面积，计算峰面积的RSD为1.53%。
2.3.3 重复性试验 取威灵仙粗粉按“2.2.2”项下方法平行制备6份样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。齐墩果酸峰面积的RSD为2.77%，表明方法重复性良好。
2.3.4 稳定性试验 取威灵仙粗粉按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，在室温下保存，分别在0，2，4，6，8，12 h测定其峰面积，计算得RSD为2.66%，表明样品在12 h内稳定性良好。
2.3.5 加样回收率试验 精密称取已知含量的市售威灵仙样品9份各1 g，分别按照样品中含量的80%，100%，120%精密加入齐墩果酸对照品各3份，按“2.2.2”项下方法制备样品溶液，测定含量，计算平均回收率为100.01%，RSD为1.82%，结果见表2。
表2 加样回收率试验结果(n=9)
Tab. 2 Results of recovery tests(n=9)
分别精密吸取样品溶液20 μL，进样，测定峰面积后计算其平均含量，测定结果见表3，色谱图见图1。
表3 样品中齐墩果酸含量的测定结果(n=3)
Tab. 3 The contents of oleanolic acid insamples (n=3)
图1 高效液相色谱图
A-齐墩果酸对照品；B-市售威灵仙；C-威灵仙；D-扬子铁线莲；E-粗齿铁线莲；F-毛蕊铁线莲；G-柱果铁线莲；H-山木通。
Fig. 1 HPLC chromatograms
A-oleanolic acid; B-C. chinensisfrom market; C-C. chinensis; D-C. ganpiniana; E-C. argentilucida; F-C. lasiandra; G-C. uncinata; H-C. finetiana.
本实验曾以95%乙醇作为溶剂，超声提取的方法未检测到齐墩果酸的含量，而采用水浴回流后加酸水解的方法提取率较高。实验还比较了水解0.5，1，2 h齐墩果酸的含量，发现1 h即可水解完全。
本实验考察了不同比例的甲醇、水为流动相，最后确定流动相为甲醇-水(90∶10)，样品中齐墩果酸得到良好的分离。从色谱图上可以看出，6种药材的皂苷元较为单一，齐墩果酸的保留时间在8.8 min左右，前后2 min内没有干扰峰，峰形对称。
齐墩果酸是威灵仙类药材主要活性成分，此次测得采集的6种不同基源威灵仙类药材中的柱果铁线莲、粗齿铁线莲、威灵仙符合中国药典2015年版规定的齐墩果酸含量>0.3%的要求。而市售川产威灵仙药材中齐墩果酸的含量则未达标，威灵仙药材流通及使用的品种混乱，直接导致药材中齐墩果酸的含量太低，影响药材质量。因此，规范市场药材品种来源，才能保证临床用药安全、有效。
实验结果表明，柱果铁线莲中齐墩果酸的含量远高于威灵仙，粗齿铁线莲中齐墩果酸的含量与威灵仙相近。因此，这两者可以考虑作为威灵仙替代资源进行研究开发。而《浙江药用植物志》[3]记载的另外2个品种毛蕊铁线莲、山木通中齐墩果酸的含量很低，能否作为威灵仙入药，还有待进一步研究。
REFERENCES
[1] 肖培根. 新编中药志[M]. 第I卷. 北京: 化学工业出版社, 2002: 681.
[2] 中国药典. 一部[S]. 2015: 附录250.
[3] 浙江药用植物志编写组. 浙江药用植物志. 上册[M]. 杭州: 浙江科学技术出版社, 1980.
[4] LUO H F, GAO X J, JIN Y. Identification of six plants ofClematisL．in Zhejiang province by TLC and ultraviolet spectral line method [J].Chin Arch Tradit Chin Med(中华中医药学刊), 2013, 31(3): 655-657.
Determination of Oleanolic Acid in Six Species of Clematis Raw Drugs from Zhejiang Province
GAO Xiaojie1, Zhang Shuili2*
(1.Second Affiliated Hospital ofZhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310005, China;2.College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053, China)
ABSTRACT:OBJECTIVETo determine contents of oleanolic acid in six species of clematis raw drugs from Zhejiang province, so as to provide a reference for medicinal resources expansion from Zhejiang province.METHODSHypersil BOS C18column (4.6 mm×150 mm, 5 μm) was used at 25 ℃, methanol-water(90∶10) was used as the mobile phase, the flow rate was 0.8 mL·min-1, the detection wavelength was 210 nm.RESULTSThe contents of oleanofic acid inClematis chinensis,C. ganpiniana, C. argentilucida, C. lasiandraandC. uncinatawere0.381%, 0.172%, 0.395%, 0.001 84%, 1.70%, while its content was too low to calculated inC. finetiana.CONCLUSIONC. uncinataandC. argentilucidacan be considered as alternative resources of medicinal clematis, but whether other species is suitable as medicine remains shall to be explored.
KEY WORDS:Clematis; oleanolic acid; HPLC; content determination
中图分类号：R284.1；R917.101
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2018)10-1511-03
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.10.017
引用本文：高晓洁, 张水利. 浙产6种威灵仙类药材中齐墩果酸的含量测定[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(10): 1511-1513.
收稿日期：2017-11-28
基金项目：浙江省中医药科技计划项目(2015ZB067)
作者简介：高晓洁，女，硕士，主管中药师 Tel: (0571)85267213 E-mail: gaoxiaojie83@163.com
*通信作者：张水利，男，博士，教授 Tel: (0571)86613576 E-mail: zhang_shuili@163.com
(本文责编：曹粤锋)