图1 Enmein的高效液相色谱图
尚校军1a,2，王淑雨1b，卢慧娟1a，马素英1a，闫福林1a*
(1.新乡医学院，a.药学院，b.国际教育学院，河南 新乡453003；2.新乡医学院第一附属医院，河南 新乡453003)
摘要：目的测定Enmein的平衡溶解度、油水分配系数，考察环糊精对其包合作用，为制剂研究奠定基础。方法采用HPLC测定Enmein在不同溶剂中的平衡溶解度；采用摇瓶法测定Enmein在不同条件下的油水分配系数；以羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)、羟丙基-γ-环糊精(HP-γ-CD)2种材料制备Enmein包合物，经溶解度试验，比较溶解性能的变化。结果(25±0.5)℃振摇24 h，Enmein在纯水中溶解度为(239.32±4.99)μg·mL-1，在多种常见的有机溶剂中微溶，在常用的药用油溶剂中不溶；正辛醇-水体系中，测得Enmein油水分配系数P为4.64，不同生理pH环境及环糊精材料，对其lgP影响不大；经过2种材料包合后，Enmein的溶解度有所提高，其中以HP-γ-CD的增溶效果最好。结论Enmein在水、常见的药用油溶剂中溶解性均不好；消化道生理pH变化及包合材料对Enmein的吸收影响不大；用Enmein的HP-γ-CD包合物为原料制备制剂，有利于提高其生物利用度。
关键词：Enmein；平衡溶解度；油水分配系数；环糊精；包合作用
Enmein是唇形科香茶菜属溪黄草植物中提取分离的二萜类活性单体成分，俗称延命草素(CAS：3776-39-4)，分子式为C20H26O6，分子量为362.42，大量研究显示，Enmein具有免疫抑制、抗肿瘤等作用[1-3]。但由于Enmein极性小，疏水性强，目前对其制剂方面研究较少，这也限制了其进一步的体内活性研究。为充分了解Enmein的理化特性，本研究测定了Enmein在水、多种常见有机溶剂、药用油溶剂等溶剂中的平衡溶解度，此外还考察了Enmein在不同pH环境中的油水分配系数，并研究了羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)和羟丙基-γ-环糊精(HP-γ-CD)2种包合材料对Enmein的包合作用，为Enmein的制剂制备和应用研究奠定基础。
LC-16高效液相色谱仪(日本岛津仪器公司)；BS224S电子分析天平(德国塞多利斯)；R206旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司)；SHA-C水浴恒温振荡器(江苏金坛佳美仪器有限公司)；ZRC-6TF智能药物溶出度仪(天津创兴电子设备制造有限公司)；TGA/DSC 2热分析仪(瑞士梅特勒-托利多)；Enmein对照品(HPLC峰面积归一化法测定其质量分数>98%)、Enmein原料(质量分数>96%)均由新乡医学院药学院天然药物化学教研室提供；羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD，湖州展望药业有限公司，批号：20090406)；羟丙基-γ-环糊精(HP-Y-CD，Aladdin，批号：40735)；其余试剂均为分析纯。
2.1.1 色谱条件 Sino Chrom ODS-Bp色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)，佳杰C18保护柱柱芯(4.6 mm×10 mm)；流动相为甲醇-水(40∶60)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：40 ℃；检测波长：237 nm；进样量：20 μL。
取Enmein对照品适量，用流动相溶解；另取Enmein的饱和乙醇、乙酸乙酯溶液、Enmein的HP-γ-CD包合物的饱和水溶液，用流动相适当稀释，分别在上述色谱条件下进样，Enmein的保留时间为6.39 min，色谱图见图1。
2.1.2 标准曲线的绘制 精密称定干燥至恒重的Enmein对照品19.1 mg，置于25 mL量瓶中，加流动相溶解并定容，制成含Enmein为764.0 μg·mL-1的储备溶液。分别精密吸取上述储备溶液50，100，200，400，800，1 000 μL，置于10 mL量瓶中，加流动相定容，配置成浓度分别为3.82，7.64，15.28，30.56，61.12，76.40 μg·mL-1的标准溶液，进样20 μL测定。
对测定结果进行分析，以药物浓度(C)对峰面积(A)进行线性回归，得回归方程为C=3.43× 10-5A-0.462(r=0.999 8，n=6)。结果表明，Enmein在3.82~76.40 μg·mL-1内线性关系良好。
图1 Enmein的高效液相色谱图
A-Enmein对照品溶液；B-Enmein乙醇溶液；C-Enmein乙酸乙酯溶液；D-Enmein-HP-γ-CD包合物溶液。
Fig. 1 HPLC chromatograms of Enmein
A-Enmein reference solution; B-Enmein ethanol solution; C-Enmein ethyl acetate solution; D-Enmein- HP-γ-CD inclusion complex solution.
2.1.3 仪器精密度试验 分别取30.56，61.12 μg·mL-1的Enmein对照品溶液，按“2.1.1”项下条件，连续进样6次，计算RSD值，结果分别为0.98%和1.12%，均<2%，表明该仪器精密度良好。
2.1.4 回收率试验[4]分别配制浓度为7.64，30.56，61.12 μg·mL-1的Enmein溶液各3份，按标准曲线得到对应浓度，依公式：回收率=测定浓度值/真实浓度值×100%，计算各浓度的回收率，均值分别为100.8%，100.1%，99.7%，RSD分别为1.08%，1.18%，0.93%，表明该方法的回收率良好。
2.1.5 稳定性试验 精密称取Enmein对照品，用流动相配制浓度为23.60，47.20，61.36 μg·mL-1的溶液，分别于0，2，4，8，12 h按“2.1.1”项下色谱条件测定，由所得峰面积计算RSD分别为1.84%，1.61%，1.66%，表明Enmein在12 h内稳定性良好。
取过量Enmein置于10 mL具塞玻璃离心管中，分别加入蒸馏水、有机溶剂或油溶剂各2 mL，将离心管于(25±0.5)℃恒温水浴振荡器中振摇24 h，离心，取上清液，过0.45 μm微孔滤膜，用甲醇稀释，按“2.1”项下方法测定，计算Enmein在各种溶剂中的平衡溶解度(n=3)，结果见表1。
表1 (25±0.5)℃ Enmein在不同溶剂中平衡溶解度
Tab. 1 Equilibrium solubilities of Enmein in different solvents at (25±0.5)℃
由表1可见，(25±0.5)℃振摇24 h，Enmein在水中的溶解度为(239.32±4.99 ) μg·mL-1，在有机溶剂中的溶解度，随着溶液极性减小而逐渐降低，在药用油溶剂中，溶解度更低。根据中国药典2015年版凡例中关于溶解度的规定，Enmein在二甲基亚砜中易溶，在四氢呋喃、乙醇、甲醇、乙腈、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、正丁醇、正辛醇中微溶，在水、二氯甲烷、聚乙二醇 400、吐温80中极微溶解，在石油醚、油酸、大豆油中不溶。
精密称取Enmein对照品，用水饱和的正辛醇溶解，配成浓度C0为91.04 μg·mL-1的溶液，备用。取10 mL具塞玻璃离心管若干，分别精密加入1 mL用正辛醇饱和的水、0.1 mol·L-1pH分别为2.0，4.0，6.0，7.4，8.0磷酸盐缓冲溶液(PBS)，依次精密加入上述Enmein溶液1 mL，置(25± 0.5) ℃恒温水浴振荡器中振摇24 h，取下层水相，过滤，按“2.1”项下方法测得Enmein浓度Cw，按公式P=(C0-Cw)/Cw计算油水分配系数，结果见表2。(25±0.5)℃，Enmein的正辛醇/水的分配系数P为4.64，lgP值为0.67，表2显示，在不同pH值磷酸盐缓冲液中，Enmein的正辛醇/缓冲液分配系数变化不大。
表2 Enmein在不同溶液中油水分配系数
Tab. 2 Oil/water partition coefficient of Enmein in different solvents
2.4.1 包合物的制备 按照原料与包合材料物质的量比1∶1，分别称取Enmein和包合材料HP-β-CD、HP-γ-CD，先将Enmein加少量丙酮溶解备用。将包合材料分别置茄形瓶中，加适量水使溶解，于磁力搅拌器上，55 ℃恒温水浴搅拌，同时缓慢滴加Enmein的丙酮溶液，滴加完成后继续保温搅拌4 h。然后55 ℃减压浓缩，使溶剂缓慢蒸出，再50 ℃真空干燥，得Enmein的 HP-β-CD、HP-γ-CD包合物。
2.4.2 包合材料中Enmein回收率的测定 分别取2种包合材料各9份，精密称定，置于量瓶中。按照包合材料与药物物质的量1∶1计算形成包合物所含Enmein的量，按此量的80%，100%，120%比例精密加Enmein对照品于对应量瓶中，然后加蒸馏水定容，配成低、中、高浓度溶液各3份，按“2.1”项下方法测定，计算相应浓度和回收率，结果HP-β-CD和HP-γ-CD中Enmein平均回收率为(98.66±1.84)%，(99.07±1.78)%。
2.4.3 包合物的鉴定 取适量Enmein、HP-β-CD、HP-γ-CD、Enmein与包合材料的物理混合物(按物质的量1∶1进行混合，以下所述物理混合物均以此比例混合)、包合物进行热重分析/差示扫描量热(thermal gravimetric analyzer/differential scanning calorimeter，TGA/DSC)分析。测定条件：以空坩埚为参比物，升温速率为10 ℃·min-1，温度范围为100~400 ℃，采样始温为100 ℃，测定气体为氮气。结果见图2~3。
图2 Enmein热重分析图
Fig. 2 Enmein thermal analysis spectra
图3 Enmein差示扫描量热图
Fig. 3 Differential thermal analysis spectra
图2显示，Enmein在300~340 ℃附近有一吸热峰之后有放热峰，综合TG与DSC曲线，此处为药物先熔融后分解之变化，因此305 ℃是Enmein熔点峰。图3可见，Enmein原料、Enmein与2种包合材料的物理混合物在305 ℃处均有峰，而HP-β-CD、HP-γ-CD和Enmein的2种包合物在此温度处无峰，表明在包合物中Enmein被完全包合。
2.4.4 包合物溶解度及油水分配系数测定 取过量Enmein、Enmein的2种包合物、Enmein与2种包合材料的物理混合物，分别置10 mL具塞离心管中，按“2.2”项下方法，均加入蒸馏水2 mL，于(25±0.5)℃水浴中振摇12 h，测定并计算溶液中Enmein的溶解度，绘制不同组成比例的Enmein溶解度图，结果见图4。
图4 Enmein溶解度图
Fig. 4 Solubility diagram of Enmein
图4显示，(25±0.5)℃水浴平衡12 h，在与2种包合材料组成的物理混合物中，Enmein的溶解度高于原料本身，而低于其包合物，表明包合物中Enmein溶解度的增加不是包合材料对Enmein的简单增溶作用。但随着振摇时间的延长，不排除物理混合物中Enmein分子与包合材料进行包合而表现出部分增溶。与Enmein原料相比，包合物分别增溶1.8倍(HP-β-CD)和5.1倍(HP-γ-CD)。
称取包合物适量，用正辛醇饱和的水溶解，分别配成Enmein浓度C1为127.97 μg·mL-1(Enmein-HP-β-CD)、180.02 μg·mL-1(Enmein-HP-γ- CD)的溶液，按“2.3”项下方法精密加入1 mL水饱和的正辛醇溶液，测水相中Enmein浓度Cw，计算油水分配系数P=(C1-Cw)/Cw，得包合物的P和lgP分别为3.97，0.60(Enmein-HP-β-CD)；5.05，0.70(Enmein-HP-γ-CD)。
表1中平衡溶解度测定结果显示，Enmein 在水、常见的药用油溶剂中溶解性均不好，不便于制备注射制剂。通常情况下，口服药物须先溶解于消化液，再以分子或离子状态通过消化道上皮细胞膜吸收，因此，制作口服制剂的药物，需有一定水溶性或脂溶性。
体外测定油水分配系数是为了模拟生物体内药物在水相和生物相之间的分配情况，从而预测其在消化道中的吸收情况[6]。人体消化道不同部位体液pH值不同，模拟生理pH值环境，本实验选择 pH 2，4，6，7.4，8来测试Enmein的油水分配系数，结果显示，不同的pH值环境对其分配系数影响不大，lgP均在0.7左右。根据-1<lgP<5[7-8]，推测Enmein在胃肠道较易被吸收，可以口服给药。
环糊精是由葡萄糖分子以糖苷键相连的低聚糖化合物，是一种毒性低、安全的药用辅料[9]，研究显示2种环糊精材料制成的Enmein包合物，均能增加Enmein的溶解度，其中以HP-γ-CD的增溶效果最好，使Enmein的溶解度增加5.1倍。测得2种包合物的lgP值，同表2中比较，变化不大，均在-1~5之间，因此推测包合材料不影响Enmein的胃肠道吸收。
Enmein原料本身溶解度低，溶出速度较慢，经消化道吸收进入体内的速度受到限制，若以Enmein的HP-γ-CD包合物为原料，制备口服制剂，如胶囊剂、散剂等，将有利于Enmein的吸收，提高其生物利用度，本研究为后期Enmein药物制剂的研发奠定基础。
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Study on Equilibrium Solubility, Oil/water Partition Coefficient and Cyclodextrin Inclusion Interaction of Enmein
SHANG Xiaojun1a,2, WANG Shuyu1b, LU Huijuan1a, MA Suying1a, YAN Fulin1a*
(1.Xinxiang Medical University, a.School of Pharmacy, b.School of International Education, Xinxiang 453003, China; 2.The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)
ABSTRACT:OBJECTIVETo determine the equilibrium solubility, oil/water partition coefficient and study the cyclodextrin inclusion complex of Enmein, provide the basis for the new preparation of Enmein.METHODSThe equilibrium solubility of Enmein in different solvents were detected by HPLC. Flask shaking method was used to determine the oil/water partition coefficients of Enmein in different conditions. The Enmein inclusion complexes were prepared with HP-β-CD and HP-γ-CD. They were compared the change with solubility.RESULTSThe equilibrium solubility of Enmein in water was (239.32± 4.99)μg·mL-1at (25±0.5)℃ for 24 h，it was slightly soluble in organic solvents, and insoluble in medical oils. The octanol-water partition coefficient of Enmein was 4.64. Different pH and cyclodextrins had little effect on lgP.The solubility of inclusion complexes were increased, in which HP-γ-CD was the stronger.CONCLUSIONEnmein has poor solubility in water and medical oils, and its absorption is less influenced by different pH and cyclodextrins. The bioavailability is significantly increased when Enmein is included by HP-γ-CD.
KEY WORDS:Enmein; equilibrium solubility; oil/water partition coefficient; cyclodextrin; inclusion interaction
中图分类号：R943
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2018)10-1447-04
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2018.10.003
引用本文：尚校军, 王淑雨, 卢慧娟, 等. Enmein的平衡溶解度、油水分配系数及环糊精包合作用的研究[J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(10): 1447-1450.
收稿日期：2018-01-10
基金项目：河南省教育厅高等学校重点科研项目(15A350010)；河南省科技攻关重点项目(122102310286)
作者简介：尚校军，女，硕士，副主任药师 Tel: (0373)3831982 E-mail: october24th@163.com
*通信作者：闫福林，男，博士，教授，硕导 Tel: (0373)3029882 E-mail:yannz2009@163.com
(本文责编：曹粤锋)