不同炮制方法对浙贝母药材3种生物碱含量的影响

浙贝母为百合科植物浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)的干燥鳞茎，是浙江道地药材“浙八味”之一。浙贝母味苦、性寒，归肺心经，具有清热化痰、开郁散结之功效[1-2]。目前浙贝母商品规格主要划分为元宝贝、珠贝、浙贝片 3类，其规格复杂，虽有优选品、大统货、小统货，但无标准等级划分，价格参差不齐，使得优质商品难露头角，而关于现有浙贝母商品规格划分标准科学内涵的研究极少，对浙贝母不同炮制方法的研究也很少。浙贝母主要成分为生物碱和皂苷，其中贝母素甲和贝母素乙的含量是中国药典 2015年版规定检测的指标成分，贝母辛在近来研究中发现其具有很好的平喘作用[3]。本研究采用HPLC-ELSD测定不同产地及不同炮制方法的浙贝母类药材中贝母素甲、贝母素乙、贝母辛的含量[4-8]，比较产地、炮制、商品规格对浙贝母生物碱含量的影响，对浙贝母生产加工有指导意义，也为浙贝母药材的质量评价、商品规格划分提供参考依据。

1 材料

1.1 试剂

对照品贝母素甲(批号：ST00370120MG)、贝母素乙(批号：ST00380120MG)、贝母辛(批号：ST07720120MG)均购自上海诗丹德生物技术有限公司，纯度均≥98%；甲醇和乙腈为色谱纯；氯仿、氨水为分析纯；实验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 仪器

Waters 1525高效液相色谱仪(美国Waters，含Empower 2色谱工作站、Waters 2424蒸发光散射检测器)；KQ2200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AR224CN型电子分析天平(奥豪斯仪器有限公司)；B-220型电热恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)。

1.3 药材

浙贝母样品为生长年限1年以上，5～6月份采收的 10个产区(浙江磐安、宁波，江苏海门等)的原药材，经浙江中医药大学张水利教授鉴定为百合科植物浙贝母(Fritillaria thunbergii Miq.)的干燥鳞茎，并按照中国药典操作规程采用 4种不同炮制方法进行炮制加工。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Hypersil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为30 ℃，流动相为乙腈(A)-0.05%的三乙胺(B)，梯度洗脱程序如下：0 min，55%A，5 min，55%A，7 min，75%A，18 min，85%A。流速为1.0 mL·min-1，采用ELSD检测，漂移管温度为 55 ℃，载气 40 psi，增益 10。进样量均为20 μL。

2.2 供试品溶液的制备

根据中国药典2015年版中浙贝母提取方法稍加改进制备供试品溶液。分别取自然干燥和硫熏浙贝母粉末(过四号筛)2 g，精密称定，置烧瓶中，加浓氨水4 mL浸润30 min，精密加入氯仿-甲醇(4∶1)的混合溶剂40 mL，称定，混匀，超声1 h，再称定，加上述混合溶剂，补足质量，滤过，精密量取续滤液10 mL，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得，备用。

2.3 对照品溶液的制备

取贝母素甲、贝母素乙和贝母辛对照品适量，精密称定，加甲醇制成含贝母素甲、贝母素乙、贝母辛浓度分别为 0.221，0.257，0.123 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 分别准确吸取已配制的对照品溶液适量，以甲醇稀释定容，得到 7个不同浓度的混合对照品溶液(贝母素甲浓度分别为0.221，0.110 5，0.066 3，0.044 2，0.035 36，0.026 52，0.017 68 mg·mL-1，贝母素乙浓度分别为 0.257，0.128 5，0.077 1，0.051 4，0.041 12，0.030 84，0.020 56 mg·mL-1，贝母辛浓度分别为 0.123，0.061 5，0.036 9，0.024 6，0.019 68，0.014 76，0.009 84 mg·mL-1)。按“2.1”项下色谱条件，分别进样20 μL测定。以lgS为纵坐标(y)，lgC为横坐标(x)作图，得贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的回归方程，见表1。

表1 3种生物碱的线性方程、相关系数及线性范围
Tab. 1 The linear equation, correlation coefficient and linear range of three alkaloids

对照品 线性方程 R2线性范围/mg·mL-1贝母辛 y=0.920 2x+5.319 6 0.999 3 0.009 84～0.123贝母素甲 y=1.195 2x+5.592 7 0.999 2 0.017 68～0.221贝母素乙 y=1.194 2x+5.489 2 0.999 1 0.020 56～0.257

2.4.2 仪器精密度考察 精密吸取混合对照品溶液 20 μL，按“2.1”项下色谱条件，连续进样 5次测定，以样品的峰面积为指标，得出贝母辛、贝母素甲和贝母素乙的相对标准偏差(RSD)分别为1.74%，1.46%，2.31%。表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性考察 取已制备的样品溶液，分别在 0，2，4，6，8，12，24 h时，按“2.1”项下色谱条件测定贝母辛、贝母素甲、贝母素乙的峰面积，计算RSD分别为0.83%，2.95，2.35%。表明样品溶液在24 h内稳定。

2.4.4 重复性考察 平行称取浙贝母药材粉末 5份，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件测定贝母辛、贝母素甲及贝母素乙的峰面积，计算RSD分别为2.89%，2.23%，2.60%，结果表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收考察 精密称取已知含量的浙贝母样品粉末2.0 g，加入浓氨溶液4 mL，浸润30 min后，置于100 mL具塞锥形瓶中，精密加入氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液40 mL。取用以上样品，分别加入含贝母辛对照品0.08，0.1，0.12 mg，含贝母素甲对照品0.8，1.0，1.2 mg，含贝母素乙对照品0.8，1.0，1.2 mg的对照品溶液，每个质量平行3份，继续按“2.2”项下方法制得供试品溶液，据标准曲线计算得出平均回收率，结果见表2。

表2 浙贝母3种生物碱加样回收结果(n=9)
Tab. 2 Sampling recovery results of three alkaloids in Fritillaria Thunbergii Bulbus (n=9)

生物碱 含量/mg·mL-1对照品加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0.800 0 1.782 0.98贝母素甲 1.025 0.800 0 1.760 0.96 0.800 0 1.892 1.04 1.000 0 2.024 1.00 1.000 0 1.958 0.97 100.1 3.02 1.000 0 2.090 1.03 1.200 0 2.178 0.98 1.200 0 2.244 1.01 1.200 0 2.310 1.04 0.800 0 1.474 1.02贝母素乙 0.029 0.800 0 1.386 0.96 0.800 0 1.430 0.99 1.000 0 1.584 0.97 1.000 0 1.606 0.98 100.1 3.29 1.000 0 1.694 1.03 1.200 0 1.848 1.00 1.200 0 1.958 1.06 1.200 0 1.848 1.00 0.080 0 0.195 0.93贝母辛 0.129 0.080 0 0.207 0.99 0.080 0 0.191 0.91 0.100 0 0.220 0.96 0.100 0 0.234 1.02 96.9 3.41 0.100 0 0.220 0.96 0.120 0 0.246 0.99 0.120 0 0.242 0.97 0.120 0 0.247 0.99

2.5 样品含量测定

分别取不同处理的浙贝母样品粉末，精密称定2.0 g，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定贝母素甲、贝母素乙和贝母辛含量。结果见图1及表3。

图1 高效液相色谱图
A-混合对照品；B-供试品溶液；1-贝母辛；2-贝母素甲；3-贝母素乙。
Fig. 1 HPLC chromatograms
A-mixed standard; B-standard solution; 1-peimine; 2-peiminine;3-peimisine.

60批浙贝母样品贝母素甲和贝母素乙总含量为0.032%～0.24%，其中S8、S21、S27、S32～S38、S41、S47、S52～S58共19组含量低于中国药典2015年版要求的最低限量(0.08%)，其余41组均符合中国药典2015年版要求的最低限量(0.08%)。不同炮制方法处理的浙贝母商品以无硫护色组贝母素甲和贝母素乙总含量最高(0.082%～0.24%，平均0.15%)，生晒处理组次之(0.058%～0.23%，平均0.13%)，硫熏处理组次之(0.032%～0.12%，平均0.092%)，贝壳灰法组含量最低(0.040%～0.12%，平均0.072%)。不同产地的浙贝母药材中含贝母素甲和贝母素乙的总量从高到低依次为磐安县仁川镇、金华市浦江县、江苏省海门县、磐安县方前镇、宁波市章水镇、宁波市鄞县鄞江镇、丽水市缙云县、磐安县新渥镇、丽水市云和县、磐安县冷水镇。实验结果表明不同产地、不同炮制方法浙贝母中生物碱含量不同，可能跟其独特的地理环境、气候及药农的种植经验等有关。结果见表3(编号 S1～S40为实地采收、炮制的浙贝片，S41～S60是实地采收、炮制的珠贝)。

表3 浙贝母药材3种生物碱含量(n=3)
Tab. 3 The content of three alkaloids in Fritillaria Thunbergii Bulbus (n=3)

注：bd-含量低于检测限。
Note: bd-below detection.

编号 产地 炮制方法 贝母辛/%贝母素甲/%贝母素乙/%乙总含量/% 编号 产地 炮制方法 贝母辛/%贝母素甲、贝母素甲/%贝母素乙/%贝母素甲、乙总含量/%S1 磐安县新渥镇 生晒处理 0.007 7 0.094 0.030 0.12 S31 磐安县新渥镇 贝壳灰法 0.011 0.057 0.029 0.086 S2 磐安县仁川镇 生晒处理 0.022 0.16 0.075 0.23 S32 磐安县仁川镇 贝壳灰法 0.004 4 0.045 0.032 0.077 S3 磐安县冷水镇 生晒处理 0.009 9 0.068 0.025 0.093 S33 磐安县冷水镇 贝壳灰法 0.006 6 0.025 0.014 0.040 S4 磐安县方前镇 生晒处理 0.007 7 0.091 0.025 0.12 S34 磐安县方前镇 贝壳灰法 0.004 4 0.037 0.019 0.056 S5 宁波市鄞县鄞江镇 生晒处理 0.015 0.11 0.051 0.16 S35宁波市鄞县鄞江镇贝壳灰法 0.007 7 0.030 0.021 0.051 S6 宁波市章水镇 生晒处理 0.011 0.089 0.042 0.13 S36 宁波市章水镇 贝壳灰法 0.005 5 0.036 0.023 0.059 S7 丽水市云和县 生晒处理 0.011 0.068 0.032 0.10 S37 丽水市云和县 贝壳灰法 0.006 6 0.036 0.023 0.059 S8 丽水市缙云县 生晒处理 0.003 3 0.039 0.020 0.059 S38 丽水市缙云县 贝壳灰法 0.007 7 0.045 0.033 0.078 S9 金华市浦江县 生晒处理 0.006 6 0.070 0.037 0.11 S39 金华市浦江县 贝壳灰法 0.007 7 0.056 0.032 0.088 S10 江苏省海门县 生晒处理 0.012 0.10 0.042 0.14 S40 江苏省海门县 贝壳灰法 0.013 2 0.073 0.046 0.12 S11 磐安县新渥镇 无硫护色 0.009 9 0.056 0.026 0.082 S41 磐安县新渥镇 硫熏处理 0.005 5 0.048 0.030 0.078 S12 磐安县仁川镇 无硫护色 0.021 0.11 0.061 0.17 S42 磐安县仁川镇 硫熏处理 0.003 3 0.068 0.047 0.12 S13 磐安县冷水镇 无硫护色 0.014 0.086 0.037 0.12 S43 磐安县冷水镇 硫熏处理 bd 0.056 0.039 0.095 S14 磐安县方前镇 无硫护色 0.021 0.13 0.064 0.19 S44 磐安县方前镇 硫熏处理 0.006 6 0.068 0.040 0.11 S15 宁波市鄞县鄞江镇 无硫护色 0.013 0.090 0.041 0.13 S45宁波市鄞县鄞江镇硫熏处理 0.006 6 0.054 0.037 0.091 S16 宁波市章水镇 无硫护色 0.020 0.097 0.061 0.16 S46 宁波市章水镇 硫熏处理 0.005 5 0.064 0.044 0.11 S17 丽水市云和县 无硫护色 0.017 0.095 0.061 0.16 S47 丽水市云和县 硫熏处理 bd 0.020 0.012 0.032 S18 丽水市缙云县 无硫护色 0.022 0.11 0.059 0.17 S48 丽水市缙云县 硫熏处理 0.006 6 0.048 0.034 0.082 S19 金华市浦江县 无硫护色 0.020 0.16 0.085 0.24 S49 金华市浦江县 硫熏处理 bd 0.080 0.036 0.12 S20 江苏省海门县 无硫护色 0.011 0.074 0.045 0.12 S50 江苏省海门县 硫熏处理 bd 0.065 0.039 0.10 S21 磐安县新渥镇 硫熏处理 0.004 4 0.044 0.024 0.068 S51 磐安县新渥镇 贝壳灰法 0.009 9 0.061 0.030 0.091 S22 磐安县仁川镇 硫熏处理 0.005 5 0.063 0.042 0.10 S52 磐安县仁川镇 贝壳灰法 0.006 6 0.043 0.031 0.074 S23 磐安县冷水镇 硫熏处理 bd 0.056 0.037 0.093 S53 磐安县冷水镇 贝壳灰法 bd 0.026 0.013 0.039 S24 磐安县方前镇 硫熏处理 0.006 6 0.066 0.039 0.10 S54 磐安县方前镇 贝壳灰法 0.004 4 0.037 0.017 0.054 S25 宁波市鄞县鄞江镇 硫熏处理 0.007 7 0.055 0.039 0.094 S55宁波市鄞县鄞江镇贝壳灰法 0.004 4 0.030 0.023 0.053 S26 宁波市章水镇 硫熏处理 0.004 4 0.059 0.042 0.10 S56 宁波市章水镇 贝壳灰法 0.005 5 0.036 0.023 0.059 S27 丽水市云和县 硫熏处理 bd 0.021 0.014 0.035 S57 丽水市云和县 贝壳灰法 0.007 7 0.039 0.025 0.064 S28 丽水市缙云县 硫熏处理 0.005 5 0.047 0.037 0.084 S58 丽水市缙云县 贝壳灰法 0.009 9 0.044 0.032 0.076 S29 金华市浦江县 硫熏处理 0.006 6 0.078 0.037 0.12 S59 金华市浦江县 贝壳灰法 0.005 5 0.062 0.035 0.097 S30 江苏省海门县 硫熏处理 0.004 4 0.065 0.039 0.10 S60 江苏省海门县 贝壳灰法 0.014 0.075 0.048 0.12

2.6 方差分析

将S1～S40浙贝片分为生晒处理、无硫护色、硫熏处理、贝壳灰法处理4个组，采用SPSS 20.0统计软件对4组数据(浙贝片贝母素甲和贝母素乙总含量)进行完全随机设计的方差分析，结果表明4组数据多个样本均数的两两比较，除生晒处理和无硫护色差异无显著性意义，硫熏处理和贝壳灰法处理差异无显著性意义，其他各样本间的差异均有统计学意义(P<0.05)，结果见表4。结果提示不同炮制方法对浙贝母药材 3种生物碱含量有影响，硫熏和贝壳灰法处理会降低浙贝母饮片生物碱的含量。贝壳灰法处理生物碱含量低可能是加工过程中擦去外皮，使得浙贝母浆汁流出，造成有效成分的流失。

分别对硫熏处理的浙贝片和珠贝、贝壳灰法处理的浙贝片和珠贝进行SPSS分析，珠贝和浙贝片各生物碱含量无显著性差异，提示不同商品规格对浙贝母生物碱含量影响不大。

表4 浙贝片贝母素甲和贝母素乙总含量方差分析结果
Tab. 4 The analysis results of Fritillaria tablets in peimine and peiminine content of total variance

注：1)P<0.05。
Note:1)P<0.05.

样品(I) 样品(J) 均值差(I-J) 标准误 显著性生晒处理 无硫护色 -0.027 10 0.015 91 0.097硫熏处理 0.036 601)0.015 91 0.027贝壳灰法 0.054 801)0.015 91 0.001无硫护色 生晒处理 0.027 10 0.015 91 0.097硫熏处理 0.063 701)0.015 91 0.000贝壳灰法 0.081 901)0.015 91 0.000硫熏处理 生晒处理 -0.036 601)0.015 91 0.027无硫护色 -0.063 701)0.015 91 0.000贝壳灰法 0.018 20 0.015 91 0.260贝壳灰法 生晒处理 -0.054 801)0.015 91 0.001无硫护色 -0.081 901)0.015 91 0.000硫熏处理 -0.018 20 0.015 91 0.260

分别对浙贝母中贝母素甲、贝母素乙和贝母辛的含量变化进行分析，发现贝母素甲和贝母素乙含量变化均为无硫护色组>生晒处理组>硫熏处理组>贝壳灰法组，这和浙贝母生物碱总含量的变化趋势是一致的，而贝母辛的含量变化为无硫护色组>生晒处理组>贝壳灰法组>硫熏处理组，提示浙贝母经硫磺熏蒸后，贝母辛下降较为严重，在S23、S27、S43、S47、S49、S50和S53这7个批次的浙贝母药材中贝母辛含量低于检测限，未检出，而这7个批次除了S53为贝壳灰法处理以外，其余 6个均为硫熏处理。由此可见，硫熏可导致浙贝母生物碱含量降低，尤其是贝母辛含量的降低，进而影响其药效。

国家已明令禁止硫熏浙贝母，而本实验结果显示硫熏和贝壳灰法处理会降低浙贝母饮片生物碱的含量，并且这 2种炮制方法生物碱含量无明显差异，对于浙贝母的采收加工，不建议用贝壳灰处理。

3 结论

所建立的方法可同时测定浙贝母饮片中的贝母素甲、贝母素乙和贝母辛，且该方法稳定、可靠、简便，适用于浙贝母的质量控制。不同炮制方法对浙贝母药材3种生物碱含量有影响，硫熏和贝壳灰法处理会降低浙贝母饮片生物碱的含量。

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