没食子酸乙酯(ethyl gallate，EG)属多酚类化合物，化学结构为3,4,5-三羟基苯甲酸乙酯，在许多中药中存在，尤其是抗肿瘤中药如狼毒大戟[1]、没食子、青龙衣[2]等。本课题组在对蒙药诃子进行化学成分研究时发现，EG在诃子中含量较高，是诃子鞣质中等极性成分的代表。近年来对EG抗肿瘤机制研究逐渐增多，集中在结肠癌和乳腺癌方面，研究发现 EG可通过上调 cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白的表达，激活线粒体通路，从而促进Lovo细胞凋亡[1]；另外EG在体外具有一定的抑制乳腺癌细胞侵袭迁移的作用，其机制与抑制MMP-2、MMP-9的mRNA水平、抑制Akt磷酸化过程和 NF-kB蛋白表达有关[3]。此外，多酚结构决定其具有良好的抗氧化作用，如EG减轻脓毒症致大鼠急性肺损伤的作用机制就与其抗氧化作用有关[4]。此前有文献报道采用 LC-MS/MS法以 EG为内标测定大鼠体内没食子酸丙酯的药动学参数[5]。本实验旨在建立一种成本更低、更简单易行的大鼠血浆中EG浓度测定方法，将该方法用于EG在大鼠体内的吸收规律研究，既为EG在药物研究领域的进一步开发利用提供理论依据，也为蒙药诃子的药动学研究奠定前期基础。
1 仪器与试剂
Agilent 1100高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，色谱柱为 Silversil C18键合硅胶柱(150 mm×4.6 mm，5 µm)；Fresco台式高速冷冻离心机(德国Heraeus公司)；微量移液器(大龙兴创实验仪器有限公司)；QL-861漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；HGC-12A氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司)；PCJ-10超纯水机(成都品成科技有限公司)。
没食子酸乙酯(EG，自制，HPLC测定纯度>98.0%)；肝素钠(西安阿尔宝生物技术有限责任公司，批号：20110412136)；牛蒡苷(中国食品药品检定研究院，批号：110819-201404，供含量测定用)；甲醇(色谱纯)、乙酸乙酯(分析纯)购自天津科密欧化学试剂有限公司。
2 方法与结果
2.1 血浆中EG含量测定方法[6-7]
2.1.1 色谱条件 色谱柱：Silversil C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.1%磷酸水(B)梯度洗脱，0～10 min，95%→90%B；10～15min，90%→70%B；15～25 min，70%→60%B；检测波长：270 nm，柱温：30 ℃，流速：1 mL·min-1。
2.1.2 系列对照品溶液及内标液的制备 取没食子酸乙酯适量，加甲醇制成浓度为 96 μg·mL-1的对照品溶液，作为对照品贮备液。取对照品贮备液适量，经逐级稀释，得到浓度分别为48，19.2，9.6，3.84，1.92，0.768，0.384，0.153 6 μg·mL-1的对照品溶液，备用。取内标物牛蒡苷适量，制成浓度为 31.2 μg·mL-1的溶液，备用。所有对照品溶液于4 ℃保存。
2.1.3 血浆样品前处理 精密吸取内标溶液50 μL于2 mL离心管中，35 ℃下空气流吹干；取血浆样品，室温解冻，涡旋混匀，精密吸取100 μL加入离心管中，涡旋3 min；加入乙酸乙酯600 μL，涡旋萃取3 min，离心5 min(4 500 ×g，4 ℃)；取上清液于另一离心管中，35 ℃下空气流吹干。残渣加甲醇 100 μL，涡旋混匀，4 500 ×g 离心 3 min，取上清20 μL进样分析。
2.1.4 方法学考察
2.1.4.1 专属性考察 分别取大鼠空白血浆、对照品溶液、实际血浆样品，按“2.1.3”项下方法制备样品溶液进行分析，记录色谱图。没食子酸乙酯保留时间约为23.5 min，内标物牛蒡苷保留时间约为30.5 min，均与相邻组分分离良好，且血浆中内源性物质不干扰样品测定。结果表明方法专属性良好。见图1。
图1 高效液相色谱图
A-空白血浆；B-标准血浆样品溶液；C-给药后血浆样品溶液；1-没食子酸乙酯；2-牛蒡苷。
Fig. 1 HPLC chromatograms
A-blank plasma; B-standard plasma sample; C-plasma sample after administration of EG; 1-ethyl gallate; 2-arctiin.
2.1.4.2 线性范围考察 取2 mL离心管9支，分别加入内标液及系列对照品溶液各50 μL，35 ℃下空气流吹干，各加空白血浆100 μL，其余操作按“2.1.3”项下方法进行，制备标准曲线溶液，测定，以对照品浓度为横坐标，对照品与内标物峰面积比值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为 y=0.349 6x-0.038 3，r=0.999 2。表明 0.153 6～96 μg·mL-1内 AEG/AIS与浓度之间有较好的线性关系。
2.1.4.3 精密度与准确度考察 取空白血浆100 μL于2 mL离心管中，分别取“2.1.2”项下标准溶液，制成浓度为 0.384，3.84，48 μg·mL-1的低、中、高 3个浓度的质控样品(QC)，按照“2.1.3”项下方法操作，每个浓度进行 5样本分析，连续测定3 d。用随行标准曲线计算各QC样品的血药浓度，分别计算日内精密度和日间精密度，并与制备浓度比较求得方法的准确度，结果见表1。
表1 精密度与准确度试验结果(n=5,x± s )
Tab. 1 Results of precision and accuracy (n=5,x± s )
结果表明，日内精密度和日间精密度值RSD<5%，相对回收率符合±15%的一般要求，表明该方法可用于EG血浆样品测定。
2.1.4.4 回收率考察 取低、中、高3个浓度的QC样品，按照“2.1.3”项下方法操作，每个浓度进行5样本分析，记录色谱峰面积。同时取各相应浓度的混合对照品溶液进样分析，记录色谱峰面积，将相应的色谱峰面积进行比较，计算提取回收率。试验结果表明，方法的提取回收率较高，见表2。
表2 提取回收率试验结果(n=5,x± s )
Tab. 2 Results of extraction recovery (n=5,x± s )
2.1.4.5 稳定性考察 取低、高2个浓度的QC样品，分别进行以下 3种条件处理：①反复冻融 3次，②常温(25 ℃)下保存 24 h，③-20 ℃保存 30 d。按照“2.1.3”项下方法操作，每个浓度进行 5样本分析。结果稳定性RSD<6.0%，表明血浆样品中EG可以被准确测定。
2.2 大鼠血浆药动学参数测定
2.2.1 血浆样品采集 取SD大鼠6只，按体质量给予80 mg·kg-1没食子酸乙酯水溶液。分别于给药后 5，10，20，40 min，1，1.5，2，4，8 h 时进行眶静脉取血，每个时间点约取血0.5 mL，置于肝素抗凝的1.5 mL离心管中，1 800×g离心10 min。移取上层血浆，置-20 ℃保存。
2.2.2 药动学参数计算 将灌服 EG 后各时间点血浆样品分批测定。取各血浆样品，解冻，按“2.1.3”项下方法操作，并进行 HPLC分析，根据随行标准曲线计算EG的血药浓度，根据实际平均血药浓度绘制血药浓度-时间曲线，结果见图2。
图2 口服给予EG后的药-时曲线图(n=6)
Fig. 2 Mean plasma concentration time curve of EG after i.g. administration (n=6)
用DAS 2.0 软件进行数据处理，以非房室模型计算主要药动学参数，权重系数选择 1/C2，所得EG大鼠血浆药动学参数结果见表3。
表3 主要药动学参数(n=6,x± s )
Tab. 3 Main pharmacokinetic parameters (n=6,x± s )
3 讨论
本实验建立HPLC测定大鼠血浆中EG含量的方法，对提取溶剂进行了选择，分别比较了使用甲醇、乙腈沉淀蛋白，结果表明空白血浆杂峰比较多，干扰测定，而乙酸乙酯萃取方法简单，溶剂易于挥散，HPLC图谱杂峰较少，空白血浆无干扰，提取回收率较高。
对EG大鼠体内吸收规律进行研究，结果表明EG的体内吸收较快，在10 min达到最大吸收，但消除相对较慢，半衰期为7.762 h。说明EG药用时，可以迅速起效，并且药效持续时间较长。这可能与 EG与血浆蛋白结合或者向体内多组织器官分布有关。后续尚需对血浆蛋白结合率及组织分布规律进行研究，以探讨EG是否具有较高的血浆蛋白结合率或者在某些组织脏器存在蓄积现象。
REFERENCES
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