重庆庙党属川党参(Codonopsis tangshen Oliv.)，主要产于重庆市巫溪县、巫山县、奉节县等地，以质柔润、参气浓烈、味甘甜、嚼之化渣而著称，热销于华南以及东南亚地区。2010年重庆庙党获得国家“地理标志产品”称号。党参主要含有糖类、苷类、甾体类、挥发油、三萜类、倍半萜内酯类等成分，其中，党参多糖、皂苷、党参炔苷等为其活性成分[1]。现代研究表明，许多植物的药效成分是其所含的次生代谢产物，而这些药效成分的形成、积累及分布与植物生长发育存在一定关系[2]。重庆庙党野生资源由于连年大量采挖，已濒临枯竭，目前已开展GAP种植。党参栽培年限一般为 3～5年，不同栽培年限对党参质量有显著影响。而由于受经济利益等驱使，重庆庙党种植区有些药农采挖种植 2年的党参作为药材，这可能导致药材质量并未达到最佳即被采挖，从而影响临床疗效。本实验以重庆庙党所含的多糖、总皂苷、党参炔苷等成分的含量为评价指标，考察重庆庙党不同生长年限(1～5年)的3种成分的动态变化，为其标准化种植、采收及质量控制提供参考。
1 材料
LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；色谱柱：Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 µm)；UV-2000紫外可见分光光度计(UNICO公司)；ME104电子天平(瑞士梅特勒-托利多)；SK8300G超声波清洗器(上海科导公司)；HH-6数显恒温水浴锅(常州市万合仪器公司)；ZDHW-1000电热套(北京中兴伟业)；RT-25小型高速粉碎机(北京兴时利和公司)。
D-无水葡萄糖对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110833-201205，供含量测定用)；人参皂苷Re(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：130324，HPLC≥98%)；党参炔苷(重庆高仁生物科技有限公司，批号：GR20140601-01，HPLC≥98%)；乙腈为色谱纯；水为双蒸水；其他试剂为分析纯。
庙党药材采集于重庆市巫山县，经重庆医科大学中医药学院何先元教授鉴定为中国药典 2015年版一部收载的桔梗科植物川党参 Codonopsis tangshen oliv.的干燥根。
2 方法与结果
2.1 多糖含量测定[3]
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取 105 ℃干燥至恒重的D-无水葡萄糖对照品3.4 mg，置10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，即得。
2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取党参药材细粉0.2 g，置圆底烧瓶中，加80%乙醇150 mL加热回流提取1 h，趁热滤过，残渣用80%热乙醇洗涤3次，每次10 mL，弃去乙醇液。将残渣及滤纸置圆底烧瓶中，加水150 mL加热回流提取1 h，趁热滤过，残渣及烧瓶用热水洗涤 4次，每次10 mL，合并滤液与洗液，放冷，转移至 250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。
2.1.3 线性关系考察 精密量取“2.1.1”项下对照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，分别置10 mL刻度试管中，各精密加入一定量的蒸馏水至2 mL，摇匀，再缓慢滴加0.2%蒽酮-硫酸溶液至10 mL(保持冰水浴)，混匀，然后100 ℃条件下保温10 min，取出，立即冷却(冰水浴10 min)，取出，测定吸光度(A)，测定波长为582 nm。以吸光度(A)为纵坐标，含量(M)为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程A=3.602 9M+0.044 1(r=0.999 1)。结果表明，本试验条件下，D-无水葡萄糖在0.034～0.204 mg内与吸光度值的线性关系良好。
2.1.4 精密度及稳定性试验 取对照品溶液连续测定6次，结果吸光度值RSD=1.59%，表明仪器精密度良好；精密量取供试品溶液 1 mL，按“2.1.3”，自“分别置10 mL刻度试管中”起，制得样品溶液，测定吸光度值，并依次放置2，4，8，12 h并测定。结果吸光度值RSD=2.73%，表明供试品溶液在12 h内测定基本稳定。
2.1.5 重复性试验 取同一批药材样品 6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，按“2.1.3”项下方法测定吸光度。结果 6份样品中多糖的平均含量为 289 mg·g-1，RSD=2.34%，表明方法重复性良好。
2.1.6 加样回收率试验 取同一批药材样品6份，精密称定，分别精密加入一定量的 D-无水葡萄糖对照品，按“2.1.2”方法制备供试品溶液。精密量取1 mL，置10 mL具塞干燥试管中，按“2.1.3”方法测定吸光度，计算加样回收率，结果见表1。结果表明，本方法加样回收率良好。
表1 多糖加样回收率试验结果表(n=6)
Tab. 1 Results of recovery test of polysaccharide(n=6)
2.2 总皂苷含量测定 经预试，参考文献方法[4]进行测定。
2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取 105 ℃干燥至恒重的人参皂苷Re对照品6.1 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得。
2.2.2 供试品溶液的制备 经考察，得供试品溶液的制备方法：精密称取党参药材粉末0.2 g，加入20 mL石油醚(60～90 ℃)，超声处理20 min，滤过。滤渣中加入50%的乙醇溶液20 mL，超声处理2次，每次30 min，滤过，滤液置于50 mL量瓶中，加入50%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀即得。
2.2.3 线性关系考察 精密量取“2.2.1”项下对照品溶液0.25，0.5，0.75，1.5，2.0，2.5 mL，分别置10 mL刻度试管中，加甲醇至刻度，摇匀。再分别取上述溶液1 mL，60 ℃水浴挥干。以空白试剂为对照，加入新配制的 5%香草醛-冰醋酸0.2 mL和高氯酸 0.8 mL，摇匀，60 ℃水浴加热20 min，取出，立即置冰水浴中冷却5 min。取出，加冰醋酸至5 mL，摇匀，在535 nm波长处测定吸收度。将吸光度(A)对人参皂苷Re含量(C/μg)作线性 回归，得 线 性回归方程 A=9.679×10-3C-0.030 6，r=0.998 7。结果表明，本试验条件下人参皂苷Re在15.25～152.5 μg内与吸光度值的线性关系良好。
2.2.4 精密度及稳定性试验 取对照品溶液连续测定6次，结果吸光度值RSD=0.94%，表明仪器精密度良好；精密量取供试品溶液1 mL，按“2.2.3”项下自“分别置10 mL刻度试管中”起，制得样品溶液，测定吸光度值，此时为 0时，往后依次放置 2，4，6，8 h并测定，结果吸光度值RSD=1.40%，表明供试品溶液在8 h内基本稳定。
2.2.5 重复性试验 取同一批药材样品 6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。精密量取1 mL，按“2.2.3”项下方法测定吸光度，结果 6份 样 品 中 总 皂 苷 平 均 含 量 为 78.2 mg·g-1，RSD=3.01%，表明方法重复性良好。
2.2.6 加样回收率试验 取同一批药材样品6份，精密称定，分别精密加入一定量的人参皂苷Re对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。精密量取1 mL，按“2.2.3”项下方法测定吸光度，计算加样回收率，结果见表2。结果表明，本方法加样回收率良好。
表2 总皂苷加样回收率试验结果表(n=6)
Tab. 2 Results of recovery test of total saponins(n=6)
2.3 党参炔苷含量测定[5]
2.3.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 µm)；流动相为乙腈-水(28∶72)；流速为 1 mL·min-1；检测波长为 269 nm；温度为 30 ℃；进样量为10 μL。理论板数按党参炔苷峰计算应≥3 000。在此色谱条件下，党参炔苷HPLC色谱图见图1。
图1 党参炔苷HPLC图
A-党参炔苷对照品；B-党参药材。
Fig. 1 HPLC chromatogram of lobetyolin
A-lobetyolin; B-sample.
2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取党参炔苷对照品5 mg，置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，即得。
2.3.3 供试品溶液的制备 精密称取药材粉末2.0 g，置100 mL锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声处理 30 min，静置至室温，称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液25 mL，水浴蒸干，用甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，即得。临用前用0.45 μm微孔滤膜滤过。
2.3.4 线性关系考察 精密吸取“2.3.2”项下对照品溶液 2，4，8，10，15，20 μL，进样，以峰面积积分值为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为 Y=603.201X-4.502 2(r=0.999 9)，结果表明，本试验条件下，党参炔苷在0.56～5.6 μg内与峰面积值的线性关系良好。
2.3.5 仪器精密度及稳定性试验 取对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积，RSD=0.39%，表明仪器精密度良好；取供试品溶液，分别于0，2，4，6，8，12 h测定，记录峰面积，RSD=1.77%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。
2.3.6 重复性试验 取同一批药材样品 6份，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.3.1”项下方法测定峰面积。结果 6份样品中党参炔苷的平均含量为 0.97 mg·g-1，RSD=2.26%，表明方法重复性良好。
2.3.7 加样回收率试验 取同一批药材粉末1.0 g，共 6份，精密称定，分别精密加入一定量的党参炔苷对照品，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液。按“2.3.1”项下方法测定峰面积，计算加样回收率，结果见表3。结果表明，本方法加样回收率良好。
表3 党参炔苷加样回收率试验结果表(n=6)
Tab. 3 Results of recovery test of lobetyolin(n=6)
2.4 样品的测定
采集 1～5年不同生长年限的重庆庙党药材，测定多糖、总皂苷、党参炔苷的含量。结果表明，重庆庙党 1～4年生长过程中，多糖含量随着生长年限的增加而增大，与第1年比较，第2年增长约42%%，第3年增长约70%，第4年增长约100%，第5年增长约90%(与第4年比较，负增长10%)；重庆庙党 1～5年生长过程中，总皂苷及党参炔苷均呈逐年递增趋势，与第1年比较，第5年总皂苷合计增长约 57%，党参炔苷合计增长约 42%。结果见表4。
3 讨论
现代研究表明，党参具有调节胃肠运动、抗溃疡、抗辐射、抗缺氧、保肝、增强机体免疫、降压、延缓衰老、保护脑缺血性损伤等药理作用，其中，党参多糖、总皂苷、党参炔苷等是其主要活性成分[6-14]。所以，本实验以党参多糖、总皂苷、党参炔苷的含量变化为评价指标，研究 1～5年不同生长年限的重庆庙党3种活性成分的动态变化，从而为重庆庙党标准化种植、采收及质量控制等提供参考。
表4 不同生长年限药材的化学成分含量(n=3)
Tab. 4 Determination of chemical components in medicinal materials with different growth years(n=3) mg·g-1
本实验研究结果表明，重庆庙党生长过程中，多糖的含量变化最明显，总皂苷和党参炔苷增加趋势较平缓。在 1～4年生长过程中，多糖含量随着生长年限的增加而增大，第4年达到最高(增加1倍左右)，而第 5年出现负增长(-10%)，这可能是随着生长年限的延长，多糖在其代谢过程中有一部分作为能量物质被消耗；总皂苷及党参炔苷均呈逐年递增趋势，总皂苷在第 3年后增加不明显，党参炔苷在第 2年后增势放缓；且重庆庙党的生长过程中多糖、总皂苷及党参炔苷三者的含量无明显的相关性。根据本研究结果，重庆庙党种植4年采收最好。
不同产地、不同采收时期的党参药材，由于生长环境以及栽培模式等的不同必然会造成化学成分含量的差异[15-16]，本实验暂未对重庆庙党不同产地及不同采收时间有效成分的含量差异进行考察，这有待进一步研究。
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