麻花秦艽花是一种常用藏药，名为“解吉嘎保”，是龙胆科植物麻花秦艽 Gentiana straminea Maxim的干燥花，具有祛风湿、清湿热、止麻痹、清热解毒的功效，用于风湿痹痛、筋脉痉挛、胃肠炎、肝炎、胆囊炎等的治疗[1-3]。藏医临床上常常将麻花秦艽花作为白花龙胆花使用，因而近年有研究认为麻花秦艽花是白花龙胆花的来源之一[4]。线叶龙胆(Gentiana farreri Balf. f.)又称蓝花龙胆，作为“邦见温保”使用，以全草或花入药，用于肝炎、肺炎、尿道感染等症的治疗[5]。
核苷类成分广泛存在于生物体中，是重要的细胞活性成分，具有维持细胞生命的功能，还具有免疫调节、改善脑细胞代谢、调节中枢神经等多种生理活性，腺苷、尿苷等重要核苷类成分已作为药品、保健品和食品添加剂服务于人类健康[6-7]。研究表明，补益类中药的补益功效与核苷类成分具有的生物活性存在一定的相关性[8]；苦碟子注射液具有的活血止痛、清热祛瘀作用与核苷类成分相关[9]；红花注射液中含有的多种核苷类成分可能是活性成分之一[10]。此外，核苷类成分可能是复方守宫散抗肿瘤的主要活性成分，被作为质量控制研究的目标成分之一[11]；硫代核苷及其衍生物具有较高的抗肿瘤，抗病毒和抗菌方面的活性[12]。
目前，麻花秦艽花和线叶龙胆花中核苷类成分的研究还未见报道，为深入开发麻花秦艽花和线叶龙胆花资源，探明麻花秦艽花和线叶龙胆花中核苷类成分的组成及含量，核苷类成分的系统研究十分必要。本实验采用 HPLC建立了麻花秦艽花和线叶龙胆花中10种核苷类成分的含量分析方法，并对采自青海多地的样品进行了分析，为藏药麻花秦艽花和线叶龙胆花的深入开发和质量控制提供参考。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1100型高效液相色谱仪，配备G1379A在线脱气机、G1312A二元高压泵、G1328A手动进样器、G1316A柱温箱、G1315B二极管阵列检测器和 Chemstation色谱工作站(美国 Agilent公司)；AG135型电子分析天平(瑞士 METTLER TOLEDO 公司)；PL203型电子分析天平(上海METTLER TOLEDO公司)；PS- 60型洁康牌超声波清洗仪(360 W，40 KHz)(东莞市洁康超声波设备有限公司)；T-25型高速匀浆机(德国IKA公司)；UPT-Ⅱ-20L型超纯水机(成都优普超纯科技有限公司)。
1.2 试药
麻花秦艽花和线叶龙胆花样品采集自青海省境内多地，采集信息见表1，样品经中国科学院西北高原生物研究所研究员卢学峰研究员鉴定为麻花秦艽花和线叶龙胆花。
核苷对照品：尿嘧啶(批号：1000996074)、鸟苷(批号：1000880080)、胸苷(批号：101063335)、胸腺嘧啶(批号：1001031694)、胞苷(批号：1001028769)、腺嘌呤(批号：1000977038)、胞嘧啶(批号：101144695)均购自 Sigma公司(Sigma-Alorich Co.美国)，纯度均≥98.0%；尿苷(批号：887-200202)、鸟嘌呤(批号：140631-200904)、腺苷(批号：110879-200202)购自中国药品生物制品检定院，纯度均≥98.0%。甲醇，色谱纯(山东禹王试剂有限公司)；自制超纯水(成都优普纯水机制)；乙酸(分析纯，西安化学试剂厂)。
表1 麻花秦艽花和线叶龙胆花样品信息
Tab.1 Sample information of flower of Gentiana straminea and flower of Gentiana farreri
2 方法与结果
2.1 混合对照品溶液的制备
分别精密称取 10种核苷对照品适量，置于10 mL的量瓶中，用20%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，混匀，配制成相应对照品贮备液，浓度分别为胞嘧啶 0.592 mg·mL-1、胞苷 0.570 mg·mL-1、尿嘧啶 0.620 mg·mL-1、腺嘌呤 0.640 mg·mL-1、鸟嘌呤 0.542 mg·mL-1、尿苷 0.480 mg·mL-1、胸腺嘧啶 0.665 mg·mL-1、鸟苷 0.583 mg·mL-1、胸苷0.685 mg·mL-1、腺苷 0.734 mg·mL-1，置于 4 ℃的冰箱内保存。临用前分别取10种核苷对照品贮备液适量混合均匀，即得混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取麻花秦艽花和线叶龙胆花样品粉末约1.0 g于50 mL锥形瓶中，精密加入10%甲醇水溶液 20 mL，混匀，浸泡 30 min；在 20 000 r·mmin-1下高速匀浆2 min；再超声提取40 min，放冷后过滤并定容于 25 mL量瓶中，摇匀后取上清液过0.45 μm滤膜后待测。
2.3 色谱条件
色谱柱：Agilent ZoRBAX Bonus-RP(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：0.04%乙酸水溶液(A)，甲醇(B)，洗脱梯度：0～25 min，0%→12%B；25～30 min，12%→25%B；30～35 min，25%→0%B；柱温35 ℃；检测波长260 nm；进样量20 μL。
在上述色谱条件下，10种核苷混合对照品溶液分析色谱图见图1A，麻花秦艽花和线叶龙胆花典型样品色谱图见图1B和1C。
图1 混合对照品溶液(A)、LDH3(B)和LDH8(C)的HPLC色谱图
1-胞嘧啶；2-胞苷；3-尿嘧啶；4-腺嘌呤；5-鸟嘌呤；6-尿苷；7-胸腺嘧啶；8-鸟苷；9-胸苷；10-腺苷。
Fig. 1 HPLC of mixed reference substances(A), sample LDH6(B) and LDH8(C)
1-cytosine; 2-cytidine; 3-uracil 4-adenine; 5-guanine; 6-uridine;7-thymine; 8-guanosine; 9-thymidine; 10-adenosine.
2.4 线性关系考察
取10种核苷对照品贮备液适量，混合，得到胞嘧啶 59.2 μg·mL-1、胞苷 57.0 μg·mL-1、尿嘧啶62.0 μg·mL-1、 腺 嘌 呤 64.0 μg·mL-1、 鸟 嘌 呤54.2 μg·mL-1、 尿 苷 48.0 μg·mL-1、 胸 腺 嘧 啶66.5 μg·mL-1、 鸟 苷 58.3 μg·mL-1、 胸 苷68.5 μg·mL-1、腺苷 73.4 μg·mL-1的混合对照品溶液。取上述混合对照品溶液适量，用 10%甲醇水溶液等倍稀释为一系列 6个不同浓度的混合对照品溶液，分别精密吸取20 μL注入高效液相色谱仪中，按“2.3”项下色谱条件进行分析，以浓度(μg·mL-1)为横坐标(X 轴)，峰面积为纵坐标(Y 轴)绘制标准曲线，建立回归方程。结果显示，10种核苷和碱基在各自的浓度范围内具有良好线性。按照信噪比分别为3和10时的浓度为检出限和定量限的定义计算各成分的检出限和定量限，结果见表2。
表2 10种核苷线性关系、检出限、定量限
Tab. 2 Regression equation, LOD and LOQ of ten components
2.5 仪器精密度试验
精密吸取同一混合对照品溶液20 μL，在“2.3”色谱条件下，连续进样6次，记录并计算10种核苷类成分各自峰面积的相对标准偏差(RSD)。10种核苷类成分色谱峰保留时间 RSD值在 0.56%～1.02%之间，峰面积RSD值在0.71%～2.33%之间，表明仪器精密度良好。
2.6 稳定性试验
取同一麻花秦艽花样品(编号：LDH1)供试品溶液，于室温放置0，2，4，8，12，24 h后，按“2.3”项下色谱条件进行分析，测定10种核苷类成分的峰面积。结果表明，样品中10种核苷类成分在24 h内峰面积的RSD值在0.92%～1.75%内，表明供试品溶液在24 h内稳定性较好。
2.7 重复性试验
取麻花秦艽花(编号：LDH1)样品5份按“2.2”项下方法制备供试品溶液，并在“2.3”项下色谱条件下进样检测，计算 10种核苷类成分含量的RSD值。结果显示，10种核苷类成分含量的RSD值在 1.29%～2.44%之间，均<2.50%，说明该方法重复性良好。
2.8 回收率试验
精密称取已知 10种核苷类成分含量的样品(编号：LDH1)6份，每份约1.0 g，分别精密加入一定量的对照品贮备溶液，按照“2.2”项下方法制备供试品溶液并按“2.3”项下条件测定，计算加标回收率，详见表3。结果表明，10种核苷及碱基平均回收率为95.1%～98.5%，RSD(n=6)均≤3.5%。
表3 10种核苷类成分加样回收率试验结果(n=6)
Tab. 3 The recovery results of 10 nucleoside compounds (n=6)
2.9 样品测定
取6批次麻花秦艽花和6批次线叶龙胆花样品，分别按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，根据“2.3”项下色谱条件分析，获得各样品中10种核苷类成分色谱峰峰面积，以外标标准曲线法计算10种核苷类成分的含量，结果见表4。
核苷类成分的分析结果显示，12批次不同产地的麻花秦艽花和线叶龙胆花样品中均含有胞嘧啶等10种核苷类成分，多批次2种龙胆花中含有的尿嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶低于定量限。不同产地线叶龙胆花中 10种核苷类成分总含量849.38～1 014.37 μg·g-1，麻花秦艽花为 256.27～822.52 μg·g-1。腺苷、鸟苷、尿苷和胞苷在麻花秦艽花和线叶龙胆花中含量均较高，是麻花秦艽花和线叶龙胆花中主要核苷成分，而尿嘧啶、鸟嘌呤和胸苷在2种样品中含量均较低。
3 讨论
3.1 提取条件的优化
不同种类的样品，由于其组成不同、质地不同，在提取核苷类成分时条件也有所不同。核苷类成分具有较好的水溶性，所以在提取条件的选择和优化的时候均采用以水为主的提取试剂，试验中根据麻花秦艽花和线叶龙胆花的特点优化了甲醇的含量。另外，为使核苷类成分充分溶出，在提取之前将细胞尽量破碎有利于核苷类成分的提取。
通过系统的试验，从细胞破碎方式和时间、提取溶剂中有机溶剂的比例等方面进行了优化。对比了水、10%，20%，40%，50%甲醇溶液对麻花秦艽花和线叶龙胆花中10种核苷类成分的提取效果。结果表明，采用10%甲醇溶液时10种核苷类成分能较好地被提取。因此，本实验采用了先将样品用10%甲醇水溶液浸泡30 min，其后用高速匀浆机 20 000 r·min-1匀浆 2 min破碎细胞，再用超声提取40 min的方法制备供试品溶液。
3.2 色谱条件的优化
核苷类成分是一类极性较大的物质，在普通的反相C18填料的色谱柱上保留和分离较差，通过具体试验，本实验中选用了具有极性物质分离特性的Bonus RP型号填料的色谱柱，并通过对流动相乙酸含量、洗脱程序的优化获得了对10种核苷具有较好分离效果的分析条件。
3.3 结果分析
麻花秦艽花和线叶龙胆花中10种核苷类成分的含量存在一定差异，在同一种样品的不同产地，该 10种成分的含量也存在差异，除个别样品(编号：LDH2)外，种内差异小于种间差异。
表4 12批样品中核苷类成分含量测定结果
Tab. 4 The result of content determination of 12 batches of samples μg·g-1
注：“-”为低于定量限。
Note: “-” is below to LOQ.
不同产地线叶龙胆花中10种核苷类成分总含量均高于麻花秦艽花。腺苷在麻花秦艽花和线叶龙胆花的10种核苷类成分中含量最高，且线叶龙胆花高于麻花秦艽花。麻花秦艽花和线叶龙胆花中胞嘧啶的含量接近；麻花秦艽花中腺嘌呤含量高于线叶龙胆花；对于鸟嘌呤含量，麻花秦艽花高于线叶龙胆花；尿苷和胸苷含量，麻花秦艽花整体低于线叶龙胆花。
不同产地麻花秦艽花中，产自玉树县巴塘乡的样品(编号：LDH2)10种核苷类成分总量及除鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胸苷外的其他 7种核苷含量均低于其他 5个产地，腺苷、鸟苷和尿苷与其他 5个产地样品比较差异很大。祁连县八宝镇(编号：LDH4)、海北州门源县(编号：LDH5)和海晏县尕海(编号：LDH6)的麻花秦艽花10种核苷总量，腺苷、尿苷和鸟苷等含量均高于其他3个产地的样品。
6个不同产地线叶龙胆花中10种核苷类成分总含量差异较小，其中最高的样品采自海北州门源县(编号：LDH10)，为 1 014.37 μg·g-1，最低的为采自玉树县巴塘乡的样品(编号：LDH8)，为849.38 μg·g-1。在 6 个产地的线叶龙胆花样品中除鸟嘌呤和胸腺嘧啶外的其余8种核苷含量差异较小。
本研究建立的 HPLC分析方法能很好地分析10种核苷类成分，其准确性、重复性和稳定性良好，适用于麻花秦艽花和线叶龙胆花药材中核苷类成分的分析。对产自青海省的 6批次麻花秦艽花和6批次线叶龙胆花样品中10种核苷类成分的测定和比较分析数据，能够为麻花秦艽花和线叶龙胆花药材品质评价和药效作用的深入研究以及质量标准的提高、完善提供参考。
REFERENCES
[1] 中国科学院西北高原生物研究所. 藏药志[M]. 西宁: 青海人民出版社, 1991: 9-11.
[2] 帝玛尔丹增彭措著, 毛继祖等重译. 晶珠本草[M]. 上海:上海科技出版社, 2012: 158-159.
[3] ZHANG X X, JIA N, SUN C, et al. Anti-inflammatory and analgesic activity of G. macrophylla Pall flower and G.straminea Maxim flower [J]. Northwest Pharm J(西北药学杂志), 2012, 27(7): 341-343.
[4] YANG F, WANG H L, LI C T, et al. Research on anti-inflammation effects of Gentiana stramimea Maxim. ’s fower [J]. Nat Prod Res Dev(天然产物研究与开发), 2010,22(2): 330-333.
[5] 刘海青, 刘亚荣, 朱志强, 等. 青海省龙胆属药用植物资源概况[J]. 中药材, 1995, 18(3): 119-125.
[6] LEE J, CHUANG T H, REDECKE V, et al. Molecular basis for the immune stimulatory activity of guanine nucleoside analogs: Activation of toll-like receptor7 [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2003, 100(11): 6646-6651.
[7] WANG R. Advances in pyrimidine [J]. Lett Biotech(生物技术通信), 2007, 18(3): 539-542.
[8] KONG D P, QIAN D W, GUO S, et al. Determination of nucleosides compounds in nine tonic traditional Chinese medicines of fruit and seeds [J]. Chin J Exp Tradit Med Form(中国实验方剂学杂志), 2011, 17(4): 98-101.
[9] LIU R. MA S M, SUN L, et al. Simultaneous determination of ten nucleoside components in Kudiezi injection by HPLC-DAD [J]. Chin Tradit Herb Drugs(中草药), 2013,44(18): 2542-2545.
[10] HU X R, SUN L, DAI Z, et al. Nucleosides in safflower injection by LC-MS and UPLC [J]. Chin Pharm J(中国药学杂志), 2013, 48(12): 1022-1026.
[11] WU J, GAO J R, HAN Y Q, et al. Simultaneous determination of nucleoside contents in Compound Shougong powder by UPLC [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学),2014, 31(7): 843-846.
[12] LIU X N, CAI Q, HAN W N. Research progress of nucleoside sulfur compounds [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2016, 33(2): 246-249.