苦豆子别名苦豆根、苦甘草，是豆科槐属植物苦豆子Sophora alopecuroides L.的干燥全草、根及种子。苦豆子中含有生物碱类、黄酮类、挥发油类以及甾类、酚类等多种化学成分，能够发挥抗炎、抗肿瘤、抗病毒及免疫调节等作用[1-3]。现有研究表明，苦豆子中的生物碱类物质是通过作用于 T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞及胞内信使物质的方式起到免疫抑制的作用[4]。本实验室利用提取过生物碱的剩余苦豆子药渣提取多糖成分，对苦豆子的二次开发利用起到了重要作用[5]。现有研究虽已证实多糖类物质能够起到增强机体免疫的功能[6]，但苦豆子多糖(polysaccharide extracted from Sophora alopecuroides，SAP)对免疫功能的调节作用尚未见详细报道。因此，本研究以MTT法体外观察SAP在不同浓度对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，并以贞芪扶正胶囊为阳性对照，探讨 SAP对环磷酰胺(cytoxan，CTX)所致免疫抑制小鼠的免疫调节作用，为开发SAP免疫调节剂提供实验依据。
1 仪器与试剂
1.1 动物
昆明种(KM)小白鼠，Ⅱ级实验动物，♀♂兼用，购自北京大学医学部实验动物科学部，实验动物合格证编号：0190751，许可证编号：SCXK(京)2006-2009。
1.2 药物与试剂
SAP，由天津市医药科学研究所制剂中心提供；RPMI1640 培养基(Gibco 公司，批号：8117203)；FCS新生小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司，批号：090605)；四甲基偶氮哇盐(MTT，Amresco公司，批号：03-2014)；脂多糖(Sigma公司，批号：026M4808V)；贞芪扶正胶囊(甘肃扶正药业科技股份有限公司，批号：090420)；CTX(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号：06052021，规格：每支200 mg)；印度墨汁(北京中预卫科生物工程公司，批号：20101029)；Na2CO3(天津市化学试剂批发公司)；都氏试剂：碳酸氢钠1.00 g，氰化钾0.05 g，高铁氰化钾0.20 g，加蒸馏水至1 000 mL；Alesver溶液：葡萄糖1.87 g，柠檬酸钠0.80 g，氯化钠0.42 g，加蒸馏水至100 mL；绵羊红细胞(SRBC)混悬液[7]。
1.3 仪器
752紫外光栅分光光度计(上海精密仪器厂)；倒置相差显微镜(日本OLYMPUS)；超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；酶联免疫检测仪(芬兰Labsystems Dragon)；CO2孵箱(美国 REVCO)；96孔培养板(德国Greinerbio-one)。
2 方法
2.1 动物分组及给药
选取健康昆明种小鼠，♀♂各半，随机分组。SAP对小鼠脾淋巴细胞增殖作用实验分为正常对照组、脂多糖组及8个不同浓度的SAP+脂多糖组，每组10只。
碳粒廓清及溶血素实验分为正常对照组、模型组、阳性药组及SAP高、中、低剂量组，每组14只。对照组灌胃给予蒸馏水 20 mL·kg-1，SAP高、中、低剂量组分别灌胃给予SAP 400，200，100 mg·kg-1，上述各组均每天灌胃给药 1次，于灌胃第25天，除正常对照组外，其余各组均腹腔注射CTX 80 mg·kg-1，每天1次，连续3 d，造成免疫功能低下模型。
2.2 体外对正常小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响
试剂的配制：将多糖样品用含 10%灭活的小牛血清的RPMI 1640培养液配成1 mg·kg-1的储备液，微孔过滤器(0.22 μm)除菌，备用。
小鼠脾单个淋巴细胞的制备[8]：将小鼠脱颈椎处死，浸泡在75%的乙醇中10 min，在超净工作台上打开小鼠腹腔，用消毒过的剪刀和镊子取出小鼠脾脏置于无菌的平皿中，去除外周结缔组织，并用不含血清的RPMI 1640培养液清洗脾脏，用无菌的针筒研磨脾脏成单个脾细胞，200目的尼龙筛网滤过，用无菌 PBS 1 500 r·min-1离心 5 min 洗涤细胞2次，细胞沉淀加入2 mL灭菌双蒸水，吹打混匀 15 s以破坏红细胞，立即加入等体积的1.8%的无菌盐水充分混匀以恢复等渗，用无菌PBS再洗涤两次，最后用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液悬浮细胞，置37 ℃恒温5% CO2孵箱中孵育 48 h，除去贴壁的巨噬细胞，悬浮的即为小鼠脾淋巴细胞。用10%胎牛血清的RPMI 1640培养液调整细胞数为 5×106·mL-1。
将细胞悬液加入 96孔细胞培养板，每孔80 μL，多糖溶液加入平板中，等比稀释成为终浓度 0.01～2.5 mg·mL-1系列 8个浓度，再加入2 μg·mL-1的脂多糖，并设相应对照。
培养与检测[9]：在 37 ℃、5% CO2条件下培养 48 h，然后各孔加入 5 mg·mL-1MTT 20 μL，继续培养 4 h。终止反应，4 h后，弃去上清液，加入DMSO 150 μL，静置30 min，振荡溶解，用酶标仪在570 nm处读取吸光值，数据结果用生物统计学方法处理。
增殖率计算：增殖率(%)=(OD样-OD对照)/OD对照×100%。
2.3 对免疫低下小鼠非特异性免疫功能的影响(小鼠碳粒廓清实验)[10]
各组小鼠在末次给药后 24 h，于眼球后按0.1 mL·(10 g)-1体质量注入印度墨汁(按 1︰3 稀释)，在注入墨汁后2 min及10 min从小鼠眼眶球后静脉丛取血0.025 mL，立刻吹入0.1% Na2CO3液2 mL，以分光光度计(λ=650 nm)比色，记录吸光度值，以下列公式计算廓清指数 K值和吞噬系数(校正吞噬系数)α 值：K=(logA1-logA2)/(t2-t1)；α=
×体质量/(肝质量+脾质量)；其中，A1，A2分别表示2，10 min时吸光度值，t1表示2 min，t2表示 10 min。取血后将小鼠颈椎脱臼处死，取动物肝、脾，并称重。
2.4 对免疫功能低下小鼠特异性体液免疫功能的影响(血清溶血素实验)[11]
末次给药后 l h小鼠摘眼球取血，室温放置l h，2 000 r·min-1离心 10 min 分离血清，将血清用生理盐水500倍稀释供测定。反应管内加入1 mL待测血清，10% SRBC 0.5 mL，10%补体(补体按照参考文献[7]制备)1 mL，置 37 ℃恒温水浴中保温30 min，然后移至冰浴中终止反应，2 000 r·min-1离心10 min，取上清液1 mL，加都氏液3 mL，摇匀，放置10 min，于540 nm波长处比色读取吸光度。测定SRBC半数溶血值：取10% SRBC 0.25 mL加都氏试剂至 4 mL，比色读取吸光度值，作为SRBC半数溶血值。样品血清半数溶血值(HC50)=样品的吸光度值/SRBC半数溶血值×稀释倍数。
3 结果
3.1 SAP对体外对正常小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响
脂多糖组与空白对照比较有显著性差异，各浓度SAP溶液协同脂多糖对淋巴细胞的增殖能力不同程度地增强，在0.6～2.5 mg·mL-1内有较好的增殖作用。结果见表1。
表1 SAP对小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响(n=10,x± s )
Tab. 1 The effects of SAP on proliferation of splenic lymphocytes in mice(n=10,x± s )
注：与空白对照组相比，1)P<0.001。
Note: Compared with control group,1)P<0.001.
3.2 SAP对 CTX致免疫功能低下小鼠非特异性免疫功能的影响
与正常对照组相比较，模型组廓清指数 K和吞噬指数a显著降低，差异有统计学意义；与模型组比较，SAP组及贞芪扶正组均能够显著增强小鼠单核巨噬细胞的吞噬功能(P<0.05)，改善小鼠巨噬细胞吞噬功能的抑制状态。结果见表2。
表2 SAP对小鼠非特异性免疫功能的影响(x± s , n=14)
Tab. 2 The effects of SAP on nonspecific immune function in mice (x± s , n=14)
注：与正常对照组相比，1)P<0.01；与模型组相比，2)P<0.05，3)P<0.01。Note: Compared with control group,1)P<0.01; Compared with model group,2)P<0.05,3)P<0.01.
3.3 SAP对免疫抑制小鼠溶血素抗体生成的影响
与模型对照组比较，SAP100，200 mg·kg-1能够显著提高小鼠的血清溶血素水平(P<0.05)，改善小鼠血清溶血素水平产生的抑制作用，具体结果见表3。
表 3 SAP对小鼠特异性体液免疫功能的影响(n=14,x± s )
Tab. 3 The effects of SAP on specific humoral immune function in mice (n=14,x± s )
注：与正常对照组相比，1)P<0.01；与模型组相比，2)P<0.05。
Note: Compared with control group,1)P<0.01; Compared with model group,2)P<0.05.
4 讨论
本实验结果表明，SAP能够不同程度地协同脂多糖提高小鼠脾淋巴细胞转换的能力，说明SAP对脾淋巴B细胞的增殖有促进作用；在非特异性细胞免疫方面，SAP能够提高碳粒廓清能力；在体液免疫方面，SAP能够提升小鼠血清溶血素水平。说明SAP在免疫系统的多个方面起到了提升的作用，具有良好的免疫调节功能。另外，碳粒廓清与溶血素实验结果显示，高剂量SAP组相较于低、中剂量未获得更好的免疫效果，而这一结果也同本实验室开展的小鼠体内抗肿瘤实验结果相一致，但与小鼠体外脾淋巴细胞增殖实验结果相反，说明SAP在体内的免疫效果不呈剂量依赖性，这可能与高浓度SAP溶解性较差，溶液黏稠，影响实验动物吸收代谢有关。然而前期预实验结果显示，在低浓度的基础上继续降低给药浓度无免疫和抗肿瘤作用，故设置高剂量组。针对以上实验结果的具体原因及SAP免疫机制本实验室将通过后续的多糖代谢定位定量研究，以期取得进一步的结果。
REFERENCES
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