图1 气相色谱图
张巍1,2，蔡犇2，李范珠1*
(1.浙江中医药大学，杭州 310053；2.浙江永宁药业股份有限公司，浙江台州 318020)
摘要：目的 建立测定依帕司他原料药中残留有机溶剂甲醇、乙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯的检测方法，为建立质量标准提供依据。方法 采用DB-624毛细管柱(30 m×0.53 mm，3.0 µm)，氢火焰离子化检测器(FID)，进样口温度210 ℃，检测器温度250 ℃，程序升温，流速3.0 mL·min-1，分流比10∶1，顶空平衡温度85 ℃，平衡时间30 min，按内标法(内标物叔戊醇)测定各残留溶剂的含量。结果 药物中7种残留溶剂的精密度RSD均<5%，在各自的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数均>0.999，平均回收率为90.0%~100.0%。结论 本方法专属性好，灵敏度高，操作简单，测定结果准确，适用于依帕司他原料药7种残留溶剂的同时测定。
关键词：依帕司他；残留溶剂；顶空气相色谱法
依帕司他是醛糖还原酶特异性抑制剂，通过阻断多元醇通路而发挥作用，主要用于治疗糖尿病神经病变，不仅对糖尿病周围神经病变有效，而且对自主神经病变也有效[1]。依帕司他辅助治疗早期糖尿病视网膜病变可显著提高临床疗效，减轻机体氧化应激及炎症反应[2]。杨卫华[3]在临床研究中证实依帕司他治疗中度非增生性糖尿病视网膜病变的疗效优于羟苯磺酸钙胶囊。国内目前关于依帕司他合成工艺的文献报道较少且都是早期的[4-6]，本实验室对于依帕司他合成工艺进行了重新设计和优化，大大提高了产品的纯度和收率。在该药的合成、精制过程中，需要用到甲醇、乙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯7种有机溶剂，为保障用药安全，根据中国药典和ICH对有机溶剂残留量测定的指导原则，需对残留溶剂建立测试方法并进行限度测定。本实验建立毛细管柱顶空气相色谱法，测定依帕司他工艺中用到的7种溶剂，并进行方法学考察。
1.1 仪器
Agilent 7890气相色谱仪(美国Agilent公司)，7697A顶空进样器，氢火焰离子化检测器(FID)，安捷伦气相色谱工作站。
1.2 材料
甲醇(批号：20140605，纯度：99.5%)、乙醇(批号：20140606，纯度：99.5%)、二氯甲烷(批号：20140606，纯度：99.5%)、正己烷(批号：20130923，纯度：99.5%)、乙酸乙酯(批号：20130116，纯度：99.5%)、四氢呋喃(批号：20140420，纯度：99.5%)、甲苯(批号：20140308，纯度：99.5%)、叔戊醇(批号：20140209，纯度：99.5%)；N,N-二甲基甲酰胺(批号：20130312，纯度：99.5%)，以上对照品及试剂均购买于国药集团化学试剂有限公司。依帕司他原料药由本实验室自制，批号140801-03。
2.1 色谱条件
毛细管色谱柱为DB-624(30 m×0.53 mm，3.0 µm)(6%氰丙基苯-94%二甲基硅氧烷)；初始温度为40 ℃，维持6 min，再以每分钟10 ℃速率升至120 ℃，维持1 min，再以每分钟20 ℃速率升至210 ℃，维持4 min；载气为氮气，流速为3.0 mL·min-1，进样口温度为210 ℃；检测器温度为250 ℃；顶空瓶平衡温度为85 ℃，定量环温度为95 ℃，传输管线温度为105 ℃，瓶加热时间为30 min，平衡时间为30 min；顶空瓶体积为20 mL，加入被测液体为2 mL，分流比为10∶1。
2.2 溶液制备
2.2.1 内标液的配制 称取叔戊醇约100 mg，置于200 mL量瓶中，用DMF稀释至刻度，混匀。
2.2.2 对照品溶液的配制 精密称取各对照溶剂适量，用内标溶液定量稀释制成每1 mL中含甲醇300 µg、乙醇500 µg、二氯甲烷60 µg、正己烷29 µg、四氢呋喃72 µg、乙酸乙酯500 µg、甲苯89 µg的混合溶液，精密量取2 mL，置20 mL顶空瓶中。
2.2.3 供试品溶液的配制 取本品约0.2 g，精密称定，置20 mL顶空瓶中，精密加入内标溶液2 mL，使溶解。
2.3 专属性试验
取内标液2 mL，置顶空瓶，按“2.1”项下色谱条件测试，记录色谱图，与对照品图谱和供试品图谱比较。结果表明：溶剂对样品测试无干扰，溶剂峰和主峰分离良好。见图1。
2.4 线性和范围
精密称取301.5 mg甲醇、503.5 mg乙醇、60.0 mg二氯甲烷、29.3 mg正己烷、508.9 mg乙酸乙酯、70.5 mg四氢呋喃和88.1 mg甲苯到一个含25 mL内标液的100 mL量瓶，再加入内标液稀释到刻度，混匀作为对照储备溶液。分别量取上述溶液1，2，3，4，5 mL到50 mL量瓶，用内标液稀释到刻度，即分别得到相对对照品溶液浓度为20%，40%，60%，80%，100%的系列溶液。分别移取2 mL溶液到顶空瓶，依次进样。记录色谱图，计算回归方程。线性测试结果见表1。
图1 气相色谱图
A-空白内标溶液；B-对照品溶液；C-供试品溶液；1-甲醇；2-乙醇；3-二氯甲烷；4-正己烷；5-乙酸乙酯；6-四氢呋喃；7-叔戊醇；8-甲苯。
Fig. 1 GC chromatograms
A-blank; B-standard solution; C-sample solutions; 1-methanol; 2-ethanol; 3-dichloromethane; 4-n-hexane; 5-ethyl acetate; 6-tetrahydrofuran; 7-tert-amyl alcohol; 8-toluene.
表1 线性关系测试结果
Tab. 1 Test results of linear relationship
2.5 精密度
2.5.1 仪器精密度及重复性 取对照品溶液2 mL至20 mL顶空瓶中，按“2.1”项下色谱条件顶空进样5次，计算每种溶剂峰面积与内标峰面积比值的RSD。结果甲醇、乙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯色谱峰与内标叔戊醇峰面积比值的RSD分别为0.8%，0.4%，0.8%，2.0%，0.9%，0.9%，0.5% (n=5)。取供试品约0.2 g，精密称定，置顶空瓶中，精密加入内标溶液2 mL使溶解，重复测定6份，结果除乙醇外，其他残留溶剂均未检出，乙醇测定值的RSD为1.4%(n=6)。
2.5.2 中间精密度 由同一人员于不同时间，分别测试同一样品残留溶剂的含量。两次测定的中间精密度RSD为1.5%。
重复性和中间精密度测试结果说明此法具有良好的精密度。
2.6 检测限
精密度试验中除乙醇检出外，其余残留溶剂均未检出，故选择响应值低(A/C)的乙醇作为代表；吸取0.676 mL对照储备溶液加内标液稀释至100 mL，混匀；分别移取2 mL溶液到顶空瓶。平行制备3份；按“2.1”项下色谱条件测试，色谱峰响应值满足信噪比S/N＝3。乙醇的最低检测限浓度为3.39 µg·mL-1。
2.7 回收率
标准溶液：移取“2.4”项下对照储备溶液4.0，5.0，6.0 mL到50 mL量瓶，用稀释液稀释到刻度，混匀，分别得到相对标准溶液浓度为80%，100%，120%的3个溶液。回收率测试液：精密称取约200 mg的供试品到顶空瓶9份，分别加入80%，100%，120%的3个浓度的溶液2 mL。每个浓度准备3份，按照前述分析方法测定。结果甲醇的平均回收率为97.02%，RSD为2.3%，乙醇的平均回收率为98.89%，RSD为2.7%，二氯甲烷的平均回收率为98.22%，RSD为2.1%；正己烷的平均回收率为94.29%，RSD为2.7% ；四氢呋喃的平均回收率为98.07%，RSD为1.8% ；乙酸乙酯的平均回收率为95.62%，RSD为2.0%；甲苯的平均回收率为97.27%，RSD为1.1%。
2.8 耐用性
分别考察顶空进样口温度改变±10 ℃、检测器温度改变±10 ℃、流速改变±0.5 mL对色谱行为的影响。耐用性试验结果表明进样口温度、检测器温度、流速的适当改变，其最低的理论板数(N≥27 662)、最低的分离度(R≥2.8)、各溶剂峰面积与内标峰面积比值的相对标准偏差最大(RSD≤2.1%)均能满足系统适用性要求，对检测结果没有影响。
2.9 样品测定
取3批样品，精密称取0.2 g到顶空瓶中，加内标液2 mL溶解，按“2.1”项下色谱条件进行测定，以内标法计算。3批供试品的残留溶剂结果均符合中国药典对残留溶剂的规定。
3.1 溶剂的选择
依帕司他为水难溶性药物，可溶解于DMF中，且DMF在专属性试验中与各溶剂对照分离良好，不干扰样品的测试，故选择DMF为测试溶剂。
3.2 内标的选择
顶空气相色谱存在的最大问题是进样体积不准。选择与残留溶剂分离良好的叔戊醇为内标物，可消除由进样体积带来的误差，提高检测的准确度。
3.3 色谱柱的选择
由于甲醇、乙醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯7种溶剂极性差异较大，色谱柱极性太大或者太小都不利于分离，通过比较，选择中等极性的DB-624色谱柱，配合程序升温可很好地分离7种有机溶剂。
3.4 柱温的选择
7种残留溶剂和内标液中，甲醇、乙醇沸点较低，乙酸乙酯和四氢呋喃极性接近，较难分离，而甲苯沸点较高，DMF沸点最高为153 ℃，故选择较低的初始温度，然后采用程序升温的方法有效地分离各残留溶剂。
本实验采用顶空气相色谱法对依帕司他原料药7种残留溶剂进行检测。结果表明该色谱条件下各残留溶剂分离良好，精密度高，在考察浓度范围内具有良好的线性关系(r>0.999)，回收率为90.0%~100.0%，符合中国药典关于有机溶剂残留量测定的要求，可以作为依帕司他原料药中残留溶剂的质量控制方法。
[1] Zheng Q r, Su Q. Pharmacologic actions and clinical utility of epalrestat [J]. Chin J New Drugs Clin Rem(中国新药与临床杂志), 2006, 25(11): 876-884.
[2] Lai X n, Du H y, Liao W f. Effect of epalrestat for auxiliary treatment of early diabetic retinopathy and its influence on serum oxidative stress and inflammation factors [J]. China Pract Med(中国实用医药), 2017, 12(1): 11-13.
[3] Yang W h. Clinical efficacy of Epalrestat for moderate non-proliferative diabetic retinopathy [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2015, 32(1): 107-110.
[4] Sheng R, Liu T, Hu Y z. Improved method of epalrestat synthesis [J]. J Zhejiang Univ(Med Sci)(浙江大学学报: 医学版), 2003, 32(4): 356-358
[5] Li Y z, Lai Y s, Liang C y. A study on the synthetic technology of epalrestat [J]. Chin J Med Chem(中国药物化学杂志), 2001, 11(3): 165-167.
[6] Yu S H, Yang F L, Zhu Q, et al. Synthesis of epalrestat [J]. Chin J Pharm(中国医药工业杂志), 1996, 27(1): 5-6.
(本文责编：曹粤锋)
Zhang Wei1,2, Cai Ben2, Li Fanzhu1*
(1.Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China; 2.Zhejiang yongning pharmaceutical co., Ltd., Taizhou 318020, China)
ABSTRACT：OBJECTIVE To establish a method for the determination of residual solvents (methanol, ethanol, dichloromethane,n-hexane, ethyl acetate, tetrahydrofuran, toluene) in epalrestat for controlling the quality of epalrestat.Methods The solvents were separated on DB-624 capillary column(30 m×0.53 mm, 3.0 µm)with programming temperature, and detected using hydrogen flame ionization detector(FID). The headspace and other chromatographic conditions were as follows: 250 ℃ of detector temperature, 3.0 mL·min-1of flow rate, 10∶1 of split ratio, 210 ℃ of inlet temperature, 85 ℃ of equilibrium temperature and 30 min of equilibrium time. The contents of residualsolvents were determined according to the internal standard method(internal standard tert-amyl alcohol). Results There were good linear relationship in the concentration ranges with correlation coefficient above 0.999, respectively. The precisions (RSD values) were less than 5% in all seven kinds of residual solvents, and the average recoveries were within 90.0%-100.0%.Conclusion This method had good specificity, high sensitivity, simple operation and accurate results. It was suitable for the determination of above 7 kinds of residual solvents in Epalrestat API at same time.
Keywords：epalrestat; residual solvent; headspace GC
中图分类号：R917.101
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2017)09-1286-03
DOI：10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.09.015
引用本文：张巍, 蔡犇, 李范珠. 顶空气相色谱法测定依帕司他有机残留溶剂的残留量[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(9): 1286-1288.
作者简介：张巍，男 Tel: (0576)84082002 E-mail: kirkwei3@hotmail.com
*通信作者：李范珠，男，博士，教授 Tel: (0571)86633030 E-mail: lifanzhu@zcmu.edu.cn
收稿日期：2017-04-26