图1 养肝增免合剂的高效液相色谱图
崔思娇1，杨光照2，汪宇1*
(1中国人民解放军第四六三医院，沈阳110042；2 沈阳陆军总院，沈阳110016)
摘要：目的 优选养肝增免合剂的澄清工艺。方法 以澄清度和阿魏酸含量为指标，在单因素试验基础上，采用正交试验考察壳聚糖加入量、pH、温度等因素对絮凝澄清工艺的影响；考察醇沉浓度、pH、醇沉时间等因素对醇沉工艺的影响。比较2种工艺在最优条件下的澄清效果。结果 壳聚糖絮凝澄清法为最佳工艺，优化工艺为壳聚糖加入量0.1%，体系pH 5.0，絮凝时体系温度为45 ℃。结论 优选的工艺条件稳定、可行，缩短了生产周期，降低了成本，可作为养肝增免合剂的澄清工艺。
关键词：养肝增免合剂；壳聚糖；阿魏酸；澄清工艺
养肝增免合剂是解放军第四六三医院院内制剂，批准文号为“沈制字(2012)F15056”，主要由西洋参、黄芪、当归、枸杞子等多味中药组成，具有滋补肝肾、益气养阴、补血填精、拟助正气的功效，用于肝肾不足型急慢性病毒性肝炎早期、恢复期的免疫协调治疗，经临床应用多年，疗效显著。为提升制剂质量，本研究对最佳条件下的2种澄清工艺的澄清效果进行比较，确定最佳工艺及其条件，为提升制剂质量提供依据，确保患者用药安全、有效。
1.1 仪器
SSI高效液相色谱仪(美国科学仪器中国有限公司)；UV6000紫外检测器(美国科学系统公司)；ESJ120-4电子分析天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)；CSF-1B超声提取器(上海医疗器械厂)；HH·S电热恒温水浴锅(江苏红旗医疗器械厂)；ZF-C型三用紫外分析仪(上海康禾光电仪器有限公司)。
1.2 试药
养肝增免合剂(中国人民解放军第四六三医院制剂室，规格为每袋100 ml，批号为20160129，20160428，20160810)；阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110773-201313)；壳聚糖(青岛海维康生物制品有限公司，批号：01106)；乙腈、甲醇(天津市四友精细化学品有限公司，色谱纯)；重蒸水(中国人民解放军第四六三医院自制)。
2.1 含量测定[1-2]
2.1.1 色谱条件 Diamonsil ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液(16∶84)；检测波长为320 nm；流速为1.0 ml·min-1；柱温为30 ℃。
2.1.2 溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称取阿魏酸对照品适量，加甲醇制成0.537 mg·mL-1的阿魏酸对照品溶液。
供试品溶液的制备：精密吸取养肝增免合剂5.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。
阴性对照品溶液的制备：按处方量并以相同工艺制备不含当归的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制得阴性对照品溶液。
2.1.3 系统适应性试验 精密吸取“2.1.2”项下对照品、供试品、阴性对照溶液各适量，按“2.1.1”项下色谱条件测定。理论板数按阿魏酸峰计算≥3 000，分离度>1.5。色谱图见图1。
2.1.4 线性关系考察 精密量取“2.1.2”项下对照品溶液，稀释成5个浓度的对照品溶液，浓度由低到高依次进样，按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积值。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标作线性回归，得到阿魏酸对照品回归方程Y=59 925X-8 751(r2=0.999 9)。结果表明，阿魏酸浓度在10.74~107.4 µg·ml-1内与峰面积呈良好的线性关系。
2.1.5 仪器精密度试验 吸取阿魏酸对照品溶液，连续重复进样6次，每次进样20 µL，测定峰面积，RSD为0.13%(n=6)，结果表明仪器精密度良好。
2.1.6 重复性试验 制备同一批号供试品溶液6份，依次进样，每次进样20 µL，结果显示，阿魏酸的平均浓度为0.134 mg·ml-1，RSD为1.28%，表明该方法重复性良好。
2.1.7 稳定性试验 吸取同一供试品溶液于0，4，8，12，16，24 h进样20 µL，结果阿魏酸峰面积RSD为1.44%。表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.1.8 加样回收率试验 精密量取养肝增免合剂(阿魏酸0.134 mg·ml-1)6份，每份5 ml，分别精密加入1.0 mL的对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，结果阿魏酸的平均回收率为97.05%，RSD为1.18%(n=6)，结果表明该方法的回收率良好。
2.2 养肝增免合剂澄清度工艺的研究[3-7]
2.2.1 溶液的配制 供试品溶液的配制：按养肝增免合剂处方配比及提取工艺制备供试品溶液。
壳聚糖澄清剂的配制：用1%的醋酸在临用前配成1%的壳聚糖胶体溶液作为絮凝剂。
2.2.2 壳聚糖澄清工艺正交试验 在前期单因素试验基础上，选择对养肝增免合剂澄清度影响较大的3个因素(絮凝时体系pH、壳聚糖加入量、温度)为考察因素，以药液的澄清度和阿魏酸含量为考察指标，取供试品溶液9份，每份50 ml，通过正交试验优选壳聚糖澄清工艺参数，因素水平表见表1，试验安排及结果见表2，方差分析见表3。
由方差分析结果可知，3个因素对指标的影响均有统计学意义，经直观分析，其影响大小顺序为絮凝时体系pH>壳聚糖的加入量>温度，综合分析正交试验结果，最终确定澄清度优化条件为A1B3C2，即壳聚糖的加入量为0.1%，絮凝时体系 pH为5.0，絮凝温度为45 ℃。
2.2.3 验证试验 取供试品药液50 ml，置于100 ml锥形瓶中，用磷酸二氢钠和柠檬酸溶液调节药液pH 5.0，45 ℃水浴中搅拌下加入0.1%的壳聚糖，低速搅拌10 min，静置12 h。依此方法进行3次验证试验，结果3份供试品溶液中阿魏酸含量平均值为70.2 μg·ml-1，RSD为1.22%。表明优选的澄清工艺稳定、可行。
图1 养肝增免合剂的高效液相色谱图
A-阿魏酸对照品；B-供试品；C-阴性对照。
Fig. 1 HPLC chromatograms of Yanggan Zengmian mixture
A-control sample; B-test sample; C-negative control sample without of angelica.
表1 因素与水平
Tab. 1 Factors and levels
表2 正交试验结果
Tab. 2 Results of the orthogonal test
表3 方差分析结果
Tab. 3 Analysis result of variance
注：F0.05(2, 2)=19.00。
Note:F0.05(2, 2)=19.00.
2.2.4 醇沉澄清工艺正交试验 前期单因素试验基础上，选择对养肝增免合剂澄清度影响较大的3个因素(醇沉浓度、系统pH、醇沉时间)为考察因素，以药液的澄清度和阿魏酸含量为考察指标，取供试品溶液9份，每份50 ml，通过正交试验优选醇沉澄清工艺参数，因素水平表见表4，试验安排及结果见表5，方差分析见表6。
表4 因素与水平
Tab. 4 actors and levels
表5 正交试验结果
Tab. 5 Results of the orthogonal test
表6 方差分析结果
Tab. 6 Analysis result of variance
注：F0.05(2, 2)=19.00。
Note:F0.05(2, 2)=19.00.
由方差分析结果可知，3个因素对指标的影响均有统计学意义，经直观分析，其影响大小顺序为醇沉时体系pH>醇沉时间>醇沉浓度，综合正交试验结果，最终确定澄清度优化条件为A2B1C2，即醇沉浓度为60%，醇沉时体系pH为5.0，醇沉时间为24 h。
2.2.5 验证试验 取供试品药液50 ml，置于100 ml锥形瓶中，用磷酸二氢钠和柠檬酸溶液调节药液pH 5.0，搅拌下分别加入乙醇使得醇沉浓度为60%，静置24 h，过滤，滤液蒸至无醇味，加水定容到50 ml。依此方法进行3次验证试验，结果3份供试品溶液中阿魏酸含量平均值为43.9 μg·ml-1，RSD为1.32%。表明优选的澄清工艺稳定、可行。
与醇沉澄清工艺相比，在取得相近澄清效果的同时，壳聚糖澄清工艺大幅度减少了有效成分阿魏酸的损失量，保证了制剂质量，而且较好地体现了中药多成分、多组分的传统特色。就用药安全性而言，壳聚糖是天然高分子物质，具有良好的生物相溶性，可生物降解，利用天然胶体保护作用使制剂澄清，使用安全[8-9]。从生产成本上考虑，与醇沉法相比，壳聚糖工艺制备方法简单，不需任何特殊设备，显著减少了劳动量，大幅度缩短了养肝增免合剂的生产周期，并且使用量极少，生产成本更低[10]。
对壳聚糖澄清工艺的研究发现，絮凝时体系pH对工艺影响最大，其原因是碱性的溶液体系中负电荷与壳聚糖产生中和作用，减弱了壳聚糖的絮凝作用，澄清效果差。酸性环境有利于壳聚糖长链分子的伸展，充分发挥其吸附架桥作用和电中和作用，但是过低的pH值也会使壳聚糖由链状变成球状，黏度下降，同样影响澄清效果。阿魏酸化学结构决定了它在碱性条件下不稳定，因此要选择合理的pH范围来保证药品质量。综合絮凝效果和有效成分损失量这2方面因素，最终选择絮凝时体系pH值为5.0。壳聚糖加入量对工艺影响也较为显著，长链结构的壳聚糖随着加入量的增加，吸附架桥作用逐渐增强，澄清效果逐步提升；但是阿魏酸含量随着壳聚糖加入量的增加呈下降的趋势，其原因可能是壳聚糖的加入导致药液中某些成分与杂质同时被絮凝沉降出来。为确保药品质量，最终选择壳聚糖的加入量为0.1%。
[1] 邓松岳, 王伟丽, 朱明伟. 高效液相色谱法测定桂丹莪棱口服液中阿魏酸含量[J]. 中国药业, 2012, 21(13): 26-27.
[2] ZHANG H Z, LI Q X, SUN B Y, et al. Simultaneous determination of bergapten and ferulic acid in seselopsis by HPLC [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2013, 30(6): 648-651.
[3] ZHAN Q, CHEN H m, YU Z m, et al. Optimization for extraction technology of Bitongxiao cataplasm by multicriteria comprehensive assessment [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2016, 33(7): 891-895.
[4] LEI C, XIA X H, HUANG M S, et al. Two purification processes of water extract from Herba Artemisiae [J]. Chin Tradit Pat Med(中成药), 2012, 35(12): 2626-2630.
[5] LU P, NI D J, GUO L J. Comparative studies on Jiangu oral liquids prepared with chitosan as the clarifier and ethanol precipitation method [J]. China Pharm(中国药师), 2012, 15(11): 1580-1582.
[6] YANG L, XIA X H, ZHU Q, et al. Study on the rule of influence of two purification methods on the chemical compositions in aqueous solution of Paeoniae Radix Alba [J]. J Chin Med Mater(中药材), 2013, 8(1): 12-15.
[7] YE B b, SHI S l. Optimization of the extracting process of total organic acid from Cassia Twig by orthogonal experiment with ethanol reflux [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2016, 33(4): 428-431.
[8] HU Y. Studies on clarifying action of Chinese herbal medicine’s water-extract with chitosan solution [J]. Jiangsu Pharm Clin Res(江苏药学与临床研究), 2002, 10(2): 23-25.
[9] SHAN D T, XIE F, LI R H. Advances in reseach on relationship between biomedical properties of chitosan and its structure [J]. New Chem Mater(化工新型材料), 2012, 40(6): 19-21.
[10] XIE W R, CHU K D, XU W, et al. Study of different natural clearing medium in clearing crafts of extraction liquid of xingbi Gels [J]. J Liaoning Univ Tcm(辽宁中医药大学学报), 2012, 5(14): 43-45.
(本文责编：蔡珊珊)
CUI Sijiao1, YANG Guangzhao2, WANG Yu1*
(1.Chinese people’s Liberation Army No. 463 Hospital, Shenyang 110042, china; 2.The General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang 110016, china)
ABSTRACT：OBJECTIVE To optimize clarification technology conditions of Yanggan zengmian mixture. METHODS With the indexes of content of ferulic acid and clarity, based on single factor test, orthogonal design was selected to optimize flocculation technology with chitosan dosage, pH, flocculation temperature as factors. To optimize alcohol precipitation process with alcohol concentration, pH, alcohol deposition time as factors. The clarification effect of the two processes was compared under the opitimized conditions. RESULTS The best clarification technology was chitosan flocculation clarification method, the optimized condition was 0.10%, chitosan flocculating agent was added at pH 5.0 and 45 ℃. CONCLUSION Flocculation clarification method is stable, reliable, short period and lowered production cost, the clarification process can be used for Yanggan Zengmian mixture.
Key words：Yanggan zengmian mixture; chitosan; ferulic acid; clarification technology
中图分类号：R944
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2017)09-1239-04
DOI：10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.09.005
引用本文：崔思娇, 杨光照, 汪宇. 养肝增免合剂澄清工艺的优选[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(9): 1239-1242.
基金项目：军队医疗机构制剂标准提高项目(13ZJZ01-5)
作者简介：崔思娇，女，硕士，药师 Tel: (024)28845262 E-mail: sijiao2228@sina.com
*通信作者：汪宇，女，博士，主任药师 Tel: (024)28845259 E-mail: Ygz463463@sina.com
收稿日期：2017-02-28