表示，组间比较采用单因素方差分析，并行正态性与方差齐性的检验，两两比较采用LSD法检验，P<0.05为差异有统计学意义。蔡兆斌1，赵旭2，赵鹏杰2，黄潇潇1，施军平3，傅晓晴1，刘寿荣1，包剑锋1*
(1.杭州市西溪医院，杭州 310000；2.浙江中医药大学，杭州 310000；3.杭州市第二人民医院，杭州 310000)
摘要：目的 利用改良的高酵母高脂饲料喂养联合氧嗪酸钾灌胃或氧嗪酸钾皮下注射，建立高尿酸血症合并非酒精性脂肪性肝病大鼠模型。方法 48只雄性SD大鼠随机分为正常对照组(A组)、高脂饲料对照组(B组)、高酵母高脂饲料+氧嗪酸钾灌胃组(C组)、高酵母高脂饲料+氧嗪酸钾皮下注射组(D组)，每组12只，造模12周，观察各组大鼠一般状况、体质量、肝湿重及血清尿酸(UA)等生化指标，并分析肝脏病理变化。结果 C、D组肝湿重明显高于A组；C组肝湿重与B组比较，差异无统计学意义；D组肝湿重明显低于B组。C、D组血清UA、CHO、TG、ALT和AST水平均明显高于A组，血清BUN与A、B组比较，差异无统计学意义；C、D组血清CREA水平明显高于A组，但与B组比较，差异无统计学意义。C、D组肝组织脂肪变性及炎性反应较A组增多。各组大鼠肾组织均无明显病变。结论 利用高酵母高脂饲料喂养联合氧嗪酸钾灌胃或氧嗪酸钾皮下注射，成功了建立高尿酸血症合并非酒精性脂肪性肝病大鼠模型，与人类发病特征相似，且无明显的肾脏损害，可作为高尿酸血症合并非酒精性脂肪性肝病的的动物模型。
关键词：高尿酸血症；非酒精性脂肪性肝病；高酵母高脂饲料；氧嗪酸钾
非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是代谢综合征的表现之一，包括脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)。据报道，NAFLD在亚洲的发病率为20%~15%[1-2]。NAFLD后期可能进展为肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌[3]。临床研究中发现，NAFLD患者中存在伴有高尿酸血症的现象[4]，尿酸的升高可能与NAFLD的进展及严重程度密切相关[5-6]。随着近年来对高尿酸血症合并NAFLD的研究日益增多，且涉及多个学科领域[7-8]，急需建立可靠且具有针对性的动物模型以辅助临床研究。本研究旨在利用改良的高酵母高脂饲料喂养联合氧嗪酸钾灌胃或氧嗪酸钾皮下注射，建立高尿酸血症合并NAFLD大鼠模型，并对其进行模型评价。
1.1 动物
SD大鼠48只，SPF级，♂，体质量为(150±10)g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。适应性饲养1周后实验，每周测量体质量1次，根据体质量调整给药剂量。
1.2 药品及试剂
氧嗪酸钾(Sigma公司)；高脂饲料、高酵母高脂饲料均购自南通特洛菲饲料科技有限公司；羧甲基纤维素钠、西黄芪树胶由浙江中医药大学动物实验中心提供。
1.3 仪器
7020全自动生化仪(日立)；KUBOTA6200型离心机(日本KUBOTA公司)；低速离心机(上海安亭仪器)；日立7180全自动生化分析仪(日本日立公司)；盖玻片、载玻片(江苏世泰)；显微镜(日本Nikon)；精密称量仪(北京赛多利斯科学仪器)。
2.1 试剂配制
氧嗪酸钾乳悬液的配制：以8 g·L-1的羧甲基纤维素钠生理盐水溶液为溶剂，配成含氧嗪酸钾25 g·L-1的生理盐水乳悬液，4 ℃冰箱储存备用。
2.2 高脂饲料和高酵母高脂饲料配制
高脂饲料：58.5%基础饲料加10.4%蛋白质、10%糖、10%脂肪、1.1%纤维素、2%维矿、2%胆固醇、5%蛋黄粉、1%胆盐等。
高酵母高脂饲料：48.5%基础饲料上加10%酵母提取物、10.4%蛋白质、10%糖、10%脂肪、1.1%纤维素、2%维矿、2%胆固醇、5%蛋黄粉、1%胆盐等。
2.3 动物模型的制备
SD大鼠适应性饲养1周后，根据大鼠体质量随机分为正常对照组(A组，普通饲料)、高脂饲料对照组(B组)、高酵母高脂饲料+氧嗪酸钾灌胃组(C组，250 mg·kg-1·d-1)、高酵母高脂饲料+氧嗪酸钾皮下注射组(D组，100 mg·kg-1·d-1)，每组12只，各组连续造模12周。各组大鼠均自由饮水，饲料控制在10 g·kg-1·d-1。每日称重并更换饲料，由于加了酵母后影响大鼠进食口感，会减少其进食量，需要控制A组、B组大鼠进食量，因此，根据C、D组大鼠的进食量(10 g·kg-1·d-1)来控制所有组的大鼠进食量，以保证各组进食量一致，防止因进食量不同产生数据误差。
2.4 检测指标及方法
大鼠每周称重1次，并观察体质量、食欲行为、状态、毛发等情况。第12周末当晚大鼠禁食不禁水16 h，次日晨称重后用3%戊巴比妥钠[0.15 ml·(100 g)-1]腹腔注射麻醉，腹腔静脉采血，分离血清，于-20 ℃保存，血清UA、CHO、TG、ALT、AST、BUN、CREA用全自动生化仪测定。
迅速分离整个肝脏称重，取右叶肝组织3 mm×3 mm×6 mm，用4%多聚甲醛(以pH 7.4的PBS配制)固定，常规石蜡包埋、HE染色，光镜下观察肝脏及肾脏形态变化。肝脏病理组织学诊断参照2010年中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的NAFLD的诊断标准进行，并进行肝脂肪变及炎症活动度分级：①根据肝细胞脂肪变性范围占所获取肝组织病理切片图的百分比，分为4度(F0~4)：F0<5%(0分)；F1为5%~33%(1分)；F2为33%~66%(2分)、F3为66%~75%(3分)；F4>75%(4分)。②依据炎症程度分为4度(G0~4)：G0无炎症(0分)；G1见少数气球样肝细胞，散在点状灶状坏死(1分)；G2肝内点灶状坏死增多，轻-中度炎细胞浸润(2分)；G3肝内灶状坏死明显，中度炎细胞浸润或伴周围炎症(3分)；G4肝内坏死灶增多，有融合性坏死，可见大量炎细胞浸润(4分)。由有经验的病理科医师在不知情的情况下阅片并做出诊断。
2.5 统计方法
数据分析采用SPSS 20.0统计软件处理。所有数据用表示，组间比较采用单因素方差分析，并行正态性与方差齐性的检验，两两比较采用LSD法检验，P<0.05为差异有统计学意义。
3.1 各组大鼠的一般状况
A、B组大鼠摄食量正常，C、D组大鼠随着造模时间的推移摄食量下降。与A组比较，B、C、D组大鼠活动量下降，反应迟钝，毛发缺乏光泽。各组均无大鼠死亡情况。
3.2 各组大鼠肝湿重及体质量比较
与A组比较，B组大鼠体质量显著减轻(P<0.05或P<0.01)；与B组比较，C组和D组大鼠体质量明显减轻(P<0.05或P<0.01)；C、D组大鼠体质量之间差异无统计学意义。与A组比较，B、C、D组大鼠肝湿重均显著增加(P<0.05或P<0.01)；B、C组大鼠肝重之间差异无统计学意义；D组大鼠肝重较B、C组显著减轻(P<0.01)。结果见表1。
表1 各组大鼠肝湿重及体质量(n=12,
)
Tab. 1 Body mass and liver wet weight of rats in each group(n=12,)
注：与A组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与B组比较，3)P<0.05，4)P<0.01；与C组比较，5)P<0.01。
Note: Compared with group A,1)P<0.05,2)P<0.01; compared with group B,3)P<0.05,4)P<0.01; compared with group C,5)P<0.01.
3.3 各组大鼠病理学比较
光镜下观察大鼠肝组织切片，A组大鼠肝组织小叶结构完整、清晰，肝细胞围绕中央静脉呈放射状分布，无脂质浸润，且汇管区及肝小叶内无炎细胞浸润；B组大鼠肝细胞排列稀疏，肝小叶内有混合性脂肪变性，但汇管区及肝小叶内极少有炎性细胞浸润；C、D组肝细胞排列紊乱、稀疏，边界欠清晰，肝小叶内呈现混合性脂肪变性，以大泡性为主，同时可见局灶性炎细胞浸润。结果见图1和表2。各组大鼠肾组织均无明显损伤，结果见图1。
3.4 各组大鼠生化指标比较
与A组比较，B组血清CHO、TG、ALT、CREA水平均显著升高(P<0.05或P<0.01)，血清UA、AST、BUN水平与A组比较，差异无统计学意义；C、D组血清UA、CHO、TG、ALT、AST、CREA水平均较显著升高(P<0.05或P<0.01)，血清BUN水平与A组比较差异无统计学意义。与B组比较，C组血清UA、ALT、AST水平均显著升高，血清CHO、TG、BUN、CREA水平与B组比较差异无统计学意义。与B组比较，D组血清UA、TG、ALT、AST水平均显著升高，血清CHO、BUN、CREA水平与B组比较差异无统计学意义。与C组比较，D组血清CHO、TG、AST显著升高，而二者血清UA、ALT、BUN、CREA之间差异无统计学意义。结果见表3。
图1 肝和组织病理(HE染色)
Fig. 1 Liver and Kidney pathology(HE)
表2 各组大鼠肝脂肪变及炎症活动度分级(n=12,)
Tab. 2 Fatty degeneration and inflammation of each group(n=12,)
注：与A组比较，1)P<0.01；与B组比较，2)P<0.01。
Note: Compared with group A,1)P<0.01; compared with group B,2)P<0.01.
表3 各组大鼠生化指标比较
Tab. 3 Biochemical indices of each group
注：与A组比较，1)P<0.05，2)P<0.01；与B组比较，3)P<0.05，4)P<0.01；与C组比较，5)P<0.01。
Note: Compared with group A,1)P<0.05,2)P<0.01; compared with group B,3)P<0.05,4)P<0.01; compared with group C,5)P<0.01.
本研究给予大鼠改良的高酵母高脂饲料喂养联合氧嗪酸钾灌胃或皮下注射，建立高尿酸血症合并非酒精性脂肪性肝病大鼠模型，模拟临床NAFLD患者常伴有高尿酸血症的情况，具有一定的临床意义。以往的研究者多用高脂饲料诱导建立NAFLD模型[9]，并被广泛认可，因此本研究设置B组作为C、D组NAFLD造模是否成功的参照。在高尿酸血症的造模上，多采用禽类或啮齿类动物[10-12]。因大鼠为哺乳动物，且较易饲养和操作，本研究选用大鼠作为动物模型，其缺陷在于大鼠体内存在尿酸酶，能将尿酸分解为尿囊素而排出体外。用于高尿酸血症造模的药物主要有次黄嘌呤[13]、腺嘌呤[14]、酵母膏[15]、氧嗪酸钾[16]等，以腺嘌呤造模较多。但腺嘌呤造模会对大鼠造成肾脏损害[17]，甚至导致大鼠死亡，考虑到动物福利和研究数据的完整性，本研究借鉴迪丽达尔•希力甫等的研究[18]，采用改良的高酵母高脂饲料喂养联合氧嗪酸钾灌胃或皮下注射的方法造模。酵母含有丰富的蛋白质、核苷酸、B族维生索等，可引起嘌呤代谢紊乱，主要表现为黄嘌呤氧化酶活性增加，加速尿酸生成，从而产生大量尿酸[19]。氧嗪酸钾是尿酸酶抑制剂，使尿酸不能经尿酸酶转化为水溶性的尿囊素，从而造成尿酸在体内的聚集[20]。
与A组比较，B组大鼠体质量虽有所减轻，但肝湿重明显增加，血清CHO、TG水平也较A组升高，肝组织脂肪变性较A组加重，证实了单纯高脂饲料喂养可诱导建立NAFLD模型。与A组比较，C组和D组肝湿重、血清UA、CHO、ALT、AST水平明显升高，血清TG水平也较A组升高，结合病理可见肝组织脂肪变性和炎性反应均较A组增多，表明造模成功。一般脂肪肝造模中，模型动物的体质量较正常组偏高[21]。本研究中观察到大鼠对高脂饲料的摄食量要低于正常对照饲料，而造模组饲料因加入了酵母导致大鼠摄食量更少，大鼠体质量比正常对照组偏轻。造模饲料与临床患者的饮食结构有一定差异，因此饲料的配制有待今后继续摸索。
C组肝湿重、血清CHO、TG水平与B组比较，差异无统计学意义；血清UA、ALT、AST水平较B组显著升高(P<0.01)，肝组织脂肪变程度与B组相当，炎性反应较B组增多。D组肝湿重与B组比较较轻(P<0.01)；血清CHO水平与B组之间差异无统计学意义；血清TG、UA、ALT、AST水平较B组显著升高(P<0.01)，肝组织脂肪变程度与B组相当，炎性反应较B组增多。C、D组血清CHO、TG水平与B组相当或高于B组，肝组织的脂肪变程度也与B组相仿，说明本模型在脂肪肝造模方面是比较可靠的。血清UA是高尿酸血症的重要指标[22]，C、D组血清尿酸均显著高于B组，说明该模型兼具了高尿酸血症的特征。ALT、AST常用于肝病的病情及疗效评估，是一个能较好反映肝细胞受损及肝脏炎症或损伤的敏感而可靠的血清学指标[23]。高尿酸血症也可导致炎性反应加重[24]，因此ALT、AST水平升高结合病理切片肝组织的炎细胞浸润，更好地佐证了本研究中模型的可靠性。
与C组比较，D组血清CHO、TG、AST水平较高(P<0.05)，二者血清UA、ALT差异无统计学意义，且肝组织脂肪变及炎症程度相当。血清BUN、CREA及肾组织病理结果提示，C、D组与A、B组比较均无明显的肾脏损害，也未造成动物死亡，这是本研究中造模的优势所在。C组与D组比较，给药方式不同，C组能更好地减轻动物的不适感，减少动物因实验造成的损伤。
综上所述，本研究利用改良的高酵母高脂饲料喂养联合氧嗪酸钾灌胃或氧嗪酸钾皮下注射，成功建立了高尿酸血症合并非酒精性脂肪性肝病大鼠模型，满足造模要求的同时，无明显的肾脏损害，为高尿酸血症合并非酒精性脂肪性肝病的研究提供了更有针对性的可靠的动物模型。
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(本文责编：蔡珊珊)
Cai Zhaobin1, Zhao Xu2, Zhao Pengjie2, Huang Xiaoxiao1, Shi Junping3, Fu Xiaoqing1, Liu Shourong1, Bao Jianfeng1*
(1.Hangzhou Xixi Hospital, Hangzhou 310000, China; 2.Zhejiang university of traditional Chinese medicine, Hangzhou 310000, China; 3.Hangzhou Second People’s Hospital, Hangzhou 310000, China)
Abstract：Objective: To establish a rat model of hyperuricemia combined with nonalcoholic fatty liver disease by feeding modified high yeast high fat diet with oxonic acid potassium intragastric administration or subcutaneous injection. Methods forty-eight male SD rats were randomly divided into 4 groups: normal control group(Group A), high-fat control group (Group B), high yeast high fat diet with oxonic acid potassium salt intragastric administration group(Group C), high yeast high fat diet with oxonic acid potassium salt subcutaneous injection group(Group D), 12 rats in each group. Body mass, liver wet weight, UA, CHO, TG, ALT, AST, BUN and CREA were respectively observed in each group. And the pathological changes were analyzed. Results After molding, the liver wet weight of the rats in Group C and Group D was significantly higher than that of Group A. The liver wet weight of Group C and Group B had no statistical difference (P>0.05). The liver wet weight of the rats in Group D was significantly lower than that of Group B (P<0.01). UA, CHO, TG, ALT, AST and CREA were significantly decreased after molding (P<0.05), but BUN was similar to Group A (P>0.05). Besides, after molding, range of fatty degeneration and inflammatory reaction in the liver tissue were increased compared with the Group A (P<0.01). While compared with Group A, there was no significant lesion in the renal tissue of rats after molding (P>0.05). Conclusion A rat model of hyperuricemia combined with nonalcoholic fatty liver disease was established successfully with no obvious kidney damage, which is similar to human pathogenesis and provide a more targeted animal model for the study of high uric acid combined with nonalcoholic fatty liver disease.
Key Words：hyperuricemia; nonalcoholic fatty liver disease; high yeast high fat diet; oxonic acid potassium
中图分类号：R965.2
文献标志码：A
文章编号：1007-7693(2017)09-1234-05
DOI：10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.09.004
引用本文：蔡兆斌, 赵旭, 赵鹏杰, 等. 不同方法建立高尿酸合并非酒精性脂肪肝模型的对比研究[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(9): 1234-1238.
基金项目：浙江省医药卫生科学研究基金计划(2010KYA164)；浙江省科技计划项目(2013C33094)；杭州市卫生科技计划项目(2012A037)
作者简介：蔡兆斌，男，硕士，主任医师，硕导 Tel: (0571)86481822 E-mail: 2633855335@qq.com
*通信作者：包剑锋，男，博士，主任中医师，教授，硕导 Tel: (0571)86481822 E-mail:zjbjf1972@aliyun.com
收稿日期：2016-12-29