牛角膜混浊和渗透性试验方法与家兔法评价染发类化妆品眼刺激性的比较研究

谢珍1，刘璐2，瞿霖吉1，何立成1，匡荣1，朱社敏1*(1.浙江省食品药品检验研究院，杭州 310052；2.浙江工业大学，杭州 310014)

摘要：目的 探讨在染发类化妆品备案审查中，用牛角膜混浊和渗透性试验(BCOP)代替家兔法(Draize试验)进行眼刺激性评价的可能性。方法分别用BCOP与Draize试验对14种市售染发剂进行眼刺激性评价，并对评价结果进行比较。结果对14种染发剂眼刺激性检测的结果表明，Draize试验所得的刺激反应等级为微刺激性-轻刺激性，按现行评审标准，通过率为100%(14/14)；BCOP所得的刺激反应等级为轻微刺激性-严重刺激性，与Draize法分类一致性达到78.6%(11/14)，以体外刺激评分值(IVIS)≤25为限值，通过率为78.6%(11/14)；以IVIS≤55为限值，通过率为85.7%(12/14)。结论用BCOP代替Draize试验对染发类化妆品进行眼刺激性评价可行。

关键词：牛角膜混浊和渗透性试验；染发剂；眼刺激性；替代方法

根据国内化妆品管理相关要求，染发类化妆品安全性评价时需进行眼刺激性试验。由于其特定的组成成分，在评价性试验中，兔眼都会产生不同程度的刺激性，有些刺激性反应还相当严重，甚至于产生腐蚀性，对兔眼造成永久性损害。2007年再版的《化妆品卫生规范》将原规范中的样品接触时间由原来的30 s改为4 s。在评审时，仍然坚持了染发类化妆品眼刺激反应等级为轻刺激性或轻刺激性以下，可予以通过。

传统的Draize试验方法目前仍是评价眼刺激性的主要方法。目前，许多关于体外眼刺激性的实验方法被广泛研究，并且通过多年的努力，多种替代方法如离体器官试验、鸡胚绒毛膜尿囊膜试验及溶血试验等体外替代试验已经逐渐走向成熟，并在实际生活中加以运用[1]，其中牛角膜混浊和渗透性试验(bovine corneal opacity and permeability，BCOP)是经济合作与发展组织(OECD)认可的眼刺激试验的替代方法之一，所以，笔者选择染发类化妆品来研究BCOP替代传统的Draize试验的可行性。即对14种市售染发剂分别用BCOP法和Draize法进行眼刺激性评价，并比较2种方法所得结果的一致性。

1 材料、仪器与试剂

测试样品为市售染发剂14种，编号1～14。

牛眼球，来源于富阳市九鲜肉牛定点屠宰场；家兔(新西兰)，普通级，♂♀皆用，体质量：1.9～2.2 kg，购自余姚市泗门镇建飞实验兔养殖场，实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2012-0050，实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2016-0009。

手持裂隙灯显微镜(苏州康捷医疗股份有限公司)；CTHI-150B型恒温恒湿箱[施都凯仪器设备(上海)有限公司]；OPACITOMETER混浊度仪(DURATEC Analysentechnik GmbH)；MAX190型紫外可见连续光谱酶标仪(美国分子仪器公司)。EME培养液、EME培养液(含酚红)、HBSS缓冲液均由Gibco公司提供；荧光素钠(国药集团化学试剂有限公司，批号：20091020)。

2 方法与结果

2.1 BCOP试验方法

小心分离角膜，周边保留2～3 mm的巩膜边缘，将其安装在特殊设计的角膜容器中，前后室均加满预热的MEM培养液，在(32±1)℃培养箱中平衡1 h，更换前后室培养液以测定角膜的基础浑浊度值，选取角膜透光值＜1 600、混浊度值＜7的牛角膜为试验用，并计算其平均混浊度值，选取与平均值相近的3只牛角膜为阴性对照，其余再根据基础浑浊度值进行分组，每组3只。用于同一次试验的牛眼球均为同一天收集的同一批眼球。分组后除去前室培养液，开窗，将测试样品按说明书进行配制后，立即取0.75 mL平铺于角膜上，盖好玻片，再置(32±1)℃孵育10 min，用MEM冲洗至样品无残留后，加满无酚红MEM培养液后孵育2 h。将前后室培养液换新后读取终混浊度值。移除前室培养液，加入4 mg·mL-1的荧光素钠溶液1 mL，孵育90 min后，收集后室液体，混匀后取360 µL在490 nm波长处读取吸光度值。按下列公式计算体外刺激评分值(in vitro irritancy score，IVIS)进行眼刺激性分类，IVIS≤3，无刺激性；3～25轻微刺激性；25.1～55，中刺激性；＞55，严重刺激性。

浊度改变值=终浊度值-基准浊度值

校正浊度值=浊度改变值-阴性对照平均浊度改变值

阴性对照平均光密度校正值=阴性对照平均光密度值-空白光密度平均值

校正光密度值=样品光密度值-阴性对照平均光密度校正值

IVIS=校正浊度值＋15×校正光密度值

2.2 Draize试验

实验前24 h，肉眼检查后，再用荧光素钠及裂隙灯对双眼进行检查，每个样品取没有眼病的健康家兔3只，将测试样品按说明书进行配制后，轻轻拉开家兔一侧眼睛的下眼睑，将0.1 mL的样品加入结膜囊中，眼闭合1 s，至第4秒时用足量、流速较快但又不会引起动物眼损伤的水流冲洗30 s，另侧眼睛不处理作自身对照，在滴入受试物后1，24，48，72 h以及第4天和第7天对动物眼睛进行检查。如果72 h未出现刺激反应，即可终止试验。对于7 d不恢复者，需延长观察时间，一般≤21 d。按《化妆品卫生规范》(2007年版)要求判定受试物对眼的刺激强度[2]。

2.3 结果

2.3.1 BCOP试验结果 笔者所在研究组前期研究结果显示[3]，14种市售染发剂BCOP试验所得的体外刺激等级为轻微刺激性-严重刺激性，其中分类为轻微刺激性的染发剂有11种，中刺激性的有1种，严重刺激性的有2种，以IVIS≤25为限值，通过率为78.6%(11/14)；以IVIS≤55为限值，通过率为85.7%(12/14)。

2.3.2 Draize 试验结果 根据《化妆品卫生规范》(2007年版)“急性眼刺激性/腐蚀性试验”中眼刺激性反应分级表来分类[2]：无刺激性与微刺激性的差别主要取决于结膜是否得分；微刺激性与轻刺激性的差别主要取决于角膜与虹膜是否得分，以及结膜得分是否＞2；轻刺激性与刺激性的区别在于7 d内得分是否能降到0。染发类化妆品Draize试验结果见表1，家兔结膜均有不同程度的红肿和充血，得分均值在2.7～6.0，所有得分在7 d内均降低到0；虹膜均未见异常，得分均为0；角膜得分均值在0～4，所有得分在7 d内均降低到0。14种染发剂Draize试验所得的刺激反应等级为微刺激性-轻刺激性，其中，等级为微刺激性的样品2种，轻刺激性样品12种，依据现行评审标准，通过率为100%。

2.3.3 2种评价方法试验结果的比较 与Draize法比较，BCOP法对于微刺激性-轻刺激性的预测敏感性为78.6%(11/14)，与体内试验总的分类一致性达到78.6%(11/14)，分类不一致的3种样品为染发剂6、8、13，体外刺激等级分别为严重刺激性、中刺激性、严重刺激性，结果见表2。

表1 染发剂Draize试验结果(n=3)
Tab. 1 Integral mean value of Draize test in hair dyes(n=3)

样品 部位 1 h 24 h 48 h 72 h 第4天 刺激反应等级样品 对照 样品 对照 样品 对照 样品 对照 样品 对照结膜 4.3 0 2.3 0 2.0 0 1.0 0 0 0染发剂1虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 0.7 0 0.7 0 0 0 0 0轻刺激性结膜 5.3 0 4.7 0 2.3 0 0.7 0 0 0染发剂2虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 3.0 0 1.3 0 0 0 0 0轻刺激性结膜 3.0 0 2.7 0 1.0 0 0.7 0 0 0染发剂3虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 1.0 0 0.7 0 0 0 0 0轻刺激性结膜 2.7 0 1.7 0 1.0 0 0 0 / /染发剂4虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 / /角膜 0 0 0 0 0 0 0 0 / /微刺激性结膜 3.0 0 2.0 0 1.0 0 0 0 / /染发剂5虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 / /角膜 0 0 0 0 0 0 0 0 / /微刺激性结膜 5.7 0 4.0 0 2.7 0 0.7 0 0 0染发剂6虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 4.0 0 1.7 0 0.7 0 0 0轻刺激性结膜 6.0 0 4.3 0 2.7 0 2.3 0 0 0染发剂7虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 3.3 0 2.3 0 1.0 0 0 0轻刺激性结膜 3.7 0 3.0 0 1.7 0 1.3 0 0 0染发剂8虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 1.0 0 0.7 0 0 0 0 0轻刺激性结膜 3.3 0 2.7 0 1.3 0 0.3 0 0 0染发剂9虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 2.0 0 0.7 0 0 0 0 0轻刺激性结膜 3.0 0 2.0 0 1.3 0 1.0 0 0 0染发剂10虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 1.0 0 0.7 0 0.3 0 0 0轻刺激性结膜 3.3 0 3.0 0 2.0 0 1.3 0 0 0染发剂11虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 3.0 0 1.0 0 0 0 0 0轻刺激性结膜 4.0 0 2.0 0 1.3 0 0 0 0 0染发剂12虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 2.3 0 1.0 0 0.3 0 0 0轻刺激性结膜 3.0 0 2.0 0 1.0 0 0.7 0 0 0染发剂13虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 1.0 0 0.7 0 0.3 0 0 0轻刺激性结膜 4.3 0 1.3 0 1.0 0 0.7 0 0 0染发剂14虹膜 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0角膜 0 0 0.7 0 0.3 0 0.3 0 0 0轻刺激性

表2 染发剂BCOP试验与Draize试验分级结果比较
Tab. 2 The comparison in classification results between BCOP assay and Draize test of hair dyes

BCOP试验分类结果无刺激性 微刺激性 轻刺激性 刺激性 腐蚀性Draize试验分类结果 合计无刺激性 0 0 0 0 0 0轻微刺激性 0 2 9 0 0 11中刺激性 0 0 1 0 0 1严重刺激性 0 0 2 0 0 2合 计 0 2 12 0 0 14

3 讨论

眼刺激试验常用于化学品分类标识，是化妆品、家居产品、农药等产品安全评价的常规项目，传统方法沿用1944年建立的Draize试验，目前我国现行的《化妆品卫生规范》(2007年版)中的“急性眼刺激性/腐蚀性试验”也是据此制定的。Draize试验属于活体动物在体试验，即向正常家兔眼内滴入或涂入受试物，暴露一定时间后，除去受试物，再采用滴入荧光素钠等手段进行观察，最长观察时间为21 d。在试验过程中，难免会使家兔不适，其中刺激性样品会给家兔带来极大的痛苦，严重侵害了动物的福利，另外还存在检测周期长，试验结果重复性差等不足[4]。多年实践结果表明，多数染发类化妆品都有不同程度的眼刺激性，用体外的眼刺激评价方法替代Draize试验，符合实验动物“3R”原则。

BCOP是OECD认可的眼刺激试验的替代方法之一，美国环保署已将BCOP作为防虫配方产品登记前的许可试验[5]，具体方法是以离体牛眼角膜作为试验系统，将角膜固定于特制挟持器内，并提供正常的生理环境，角膜分隔夹持器为前后两室，将受试物直接与前室角膜上皮表面接触一段时间后，刺激物能引起角膜生理屏障功能破坏和基质蛋白变性，通过检测角膜混浊度及渗透性的改变，可定量检测刺激性的程度，根据评分进行分类。该方法的优点为成本低，不受样品剂型、溶解性的限制，必要时增加角膜组织学切片还可用于分析角膜损伤的机制[6]。

本研究对14种市售染发剂同时采用2种方法进行眼刺激性评价，并对评价结果进行比较。结果表明，Draize试验所得的刺激反应等级为微刺激性-轻刺激性，按现行评审标准，通过率为100%(14/14)；BCOP所得的刺激反应等级为轻微刺激性-严重刺激性，由于本次试验样本量较小，BCOP所得的刺激反应等级与体内试验的分类一致性为78.6%(11/14)，在后续研究中，笔者将扩大样本量，对更多种类的染发类化妆品进行眼刺激评价，丰富数据。通过率方面，以IVIS≤25为限值，通过率为78.6%(11/14)；以IVIS≤55为限值，通过率为85.7%(12/14)，表明BCOP法在评价染发类化妆品眼刺激性方面比Draize法控制更为严格，分析原因如下：①Draize法样品接触时间(4 s)、冲洗过程(30 s)和冲洗的程度都会对试验结果产生较大的影响，特别是接触时间的掌握难以控制。②评分标准主观性强。当刺激强度为轻刺激性及以上时，眼刺激性反应分级只与恢复时间(≤7 d、8～21 d或＞21 d)有关，而与角膜、结膜的即时刺激强度无关，染发类化妆品引起的结膜充血与水肿，一般在7 d内均可恢复，角膜损害的恢复与否，直接关系到样品是轻刺激性还是刺激性，乃至腐蚀性最终判断。而角膜损害的观察，主要是靠肉眼，观察过程中还要受到裂隙灯光源的强度、光源的颜色及光源射入方向等外在因素的影响，同时在恢复期结果观察时，角膜的损害随着时间的推移越来越小，观察的难度逐渐增加，受主观影响的可能性也越来越大，在观察时容易主观性忽略细小损害，接受无损害的结果，特别是3只家兔角膜损害恢复情况不一致的时候。而BCOP法是将样品直接与角膜接触，定量检测角膜的混浊度及渗透性，将刺激性的程度量化，使结果评定更加客观。③染发类化妆品使用前需进行配制，但配制后存放一定时间，刺激性会下降[3]。传统的Draize法，染发类化妆品调制后涂入兔眼过程复杂，从配制好到涂入家兔眼中一般都需要一定的时间，3只家兔因涂入时间不一致也可能造成实验结果差异较大，而每只家兔都重新配制样品也不切实际，而BCOP法可以严格控制配制后存放时间，可以保证在1 min内，3只牛眼加样完毕。在染发类化妆品实际使用过程中，虽然配制后马上进入人眼的可能性不大，但也存在这样的可能性，而安全性评价应该要充分考虑这方面的因素。

本研究结果表明，对于染发类化妆品，用BCOP法替代现行的家兔活体评价系统，具有较好的可行性，既可以保证染发类化妆品眼刺激的安全性，又遵循了动物实验的“3R”原则，缩短了实验周期，结果判定更加客观。同时，对市售染发剂进行眼刺激安全性检测与评估，可为化妆品监管和消费者提供数据参考，具有广泛应用价值。

REFERENCES

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Comparative Study on Eye Irritation Prediction Using Bovine Corneal Opacity Permeability Assay and Draize Test of Hair Dyes

XIE Zhen1, LIU Lu2, QU Linji1, HE Licheng1, KUANG Rong1, ZHU Shemin1*
(1.Zhejiang Institute of Food and Drug Control, Hangzhou 310052, China; 2.Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

ABSTRACT：OBJECTIVE To explore the feasibility of the bovine corneal opacity permeability assay instead of Draize test for eye irritation evaluation of hair dyes.METHODSFourteen kinds of hair dyes form market were selected to predict ocular irritation by BCOP assay, the calculated in vitro irritancy score(IVIS) were compared with the results of Draize in vivo rabbit test.RESULTSThe test results of fourteen kinds of hair dyes products showed that the classification results from Draize test was light-moderate irritation, the passing rate was 100%(14/14) according to current standards, the BCOP assay was slight-severe irritation, the total classification consistency of BCOP and Draize test reached 78.6%(11/14), took the IVIS≤25 as limiting value, the passing rate was 78.6%(11/14); and the passing rate was 85.7%(12/14) when the limiting value was IVIS≤55.CONCLUSIONThe results suggest that BCOP assay can be used in eye irritation evaluation for hair dyes.

KEY WORDS：BCOP; hair dyes; ocular irritation; alternative method

中图分类号：R917

文献标志码：B

文章编号：1007-7693(2017)07-1025-04

DOI：10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.07.021

引用本文：谢珍, 刘璐, 瞿霖吉, 等. 牛角膜混浊和渗透性试验方法与家兔法评价染发类化妆品眼刺激性的比较研究[J].中国现代应用药学, 2017, 34(7)： 1025-1028.

收稿日期：2016-01-13

(本文责编：李艳芳)

基金项目：浙江省食品药品监管系统科技计划项目(2015007)

作者简介：谢珍，女，硕士，药师 Tel： (0571)86457970 E-mail： cheerxie@163.com*

通信作者：朱社敏，女，主任药师 Tel：(0571)86457970 E-mail： cnczsm@126.com