基于全时段多波长融合指纹图谱的“一测多评”法测定中药木蝴蝶总黄酮中5种主要成分

李楠楠1，孟宪生1,2,3*，包永睿1,2,3，王帅1,2,3，李天骄1,2,3(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600；2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁 大连 116600；3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁 大连 116600)

摘要：目的 基于中药木蝴蝶总黄酮全时段多波长融合指纹图谱，建立一种使用一个对照品，同步计算中药木蝴蝶总黄酮中多个成分的定量分析方法。方法采用UPLC，Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流动相为0.1%的甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，进行梯度洗脱(0～10 min，15%→57%B；10～15 min，57%→65%B)，柱温为30 ℃，检测波长为256，280，300，320，350 nm，流速为0.4 mL·min-1。结果外标法与一测多评法测得的结果无显著性差异，系统适用性考察结果显示该方法具有良好的系统适用性。结论建立了中药木蝴蝶“一测多评”的含量测定方法，该方法简单、科学、准确，可以减少对照品的使用量，节约实验成本，可以为中药木蝴蝶的质量控制提供依据。

关键词：中药木蝴蝶；一测多评；相对校正因子；多成分含量测定

中药木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶Orozylum indicum (L.) Vent.的干燥成熟种子[1]，主要含有木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、槲皮素、山奈酚、芹菜素、黄芩素、白杨素等黄酮、黄酮醇及其苷类[2-3]，具有镇痛、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理作用[4-6]。木蝴蝶药材现载入中国药典2015年版(一部)，药典中以木蝴蝶苷B为含量测定项。本实验室前期对木蝴蝶总黄酮类化学成分表征及抗肿瘤体外药效研究表明，纯化后的木蝴蝶总黄酮中主要成分为木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、白杨素、黄芩素，且纯化后总黄酮对肝癌细胞的抑制作用大于纯化前，说明黄酮类成分是木蝴蝶发挥抗肿瘤作用的药效组分。所以，对木蝴蝶的质量评价，仅对一个黄酮类成分进行质量控制并不能全面控制木蝴蝶的质量，需要对其多种成分同时进行质量控制。但是，木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品价格昂贵，所以本研究基于全时段多波长融合指纹图谱，采用一测多评的方法，以廉价易得的白杨素含量为指标，通过计算各成分的相对校正因子，计算中药木蝴蝶总黄酮中的其他成分的含量。本实验采用外标法同时测定木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷 B、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、黄芩素、白杨素5种成分的含量，与外标法进行对比，并对系统的适用性进行考察，验证一测多评法的准确性和科学性，为中药木蝴蝶的多指标质量控制和较全面评价木蝴蝶药材质量奠定基础。

1 仪器与试药

Agilent 1290型高效液相色谱仪，Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)(美国Agilent)；ACCULAB ALC-11C.4型电子天平(德国赛多利斯集团)；木蝴蝶药材(大连同仁堂药房，产地分别为广西、贵州、湖南张家界、四川、云南昆明、云南大理、云南丽江、安徽亳州，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为Orozylum indicum (L.) Vent.的干燥成熟种子)；木蝴蝶苷A对照品(批号：130821，纯度：98.4%)、木蝴蝶苷B对照品(批号：130810，纯度：98.4%)购自四川省维克奇生物科技有限公司；黄芩素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：111595-200301，纯度：98.3%)；白杨素对照品(成都普菲德生物科技有限公司，批号：150306，纯度：98.4%)；白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号：35775-49-6，纯度：98.4%)；甲酸色谱纯、甲纯色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 方法原理

设样品中白杨素的峰面积为Ab，浓度为Cb，则fb=Ab/Cb①。样品中白杨素与黄芩素的相对校正因子为f=fb/fh=(Ab×Ch)/(Ah×Cb)②。由此可得黄芩素定量计算公式：Ch=f×Ah×Cb/Ab③。式中Ah为黄芩素峰面积，Ch为黄芩素浓度，以此可以计算出样品中木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的含量[7-9]。

2.2 供试品溶液制备

根据本实验室前期研究基础，取各产地的中药木蝴蝶，按照木蝴蝶总黄酮最佳提取纯化工艺进行有效组分的提取、纯化。取纯化后木蝴蝶总黄酮约0.2 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，制成供试品溶液，备用。

2.3 对照品溶液的制备

取木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷和黄芩素对照品适量，精密量取，加甲醇制成木蝴蝶苷A 1.002 mg·mL-1、木蝴蝶苷B 0.956 mg·mL-1、白杨素0.124 mg·mL-1、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷0.368 mg·mL-1、黄芩素0.208 mg·mL-1的对照品溶液。将木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、白杨素、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品溶液分别精密吸取100 μL，黄芩素对照品溶液精密吸取200 μL混匀，制成混合对照品溶液，备用。

2.4 色谱条件

色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，Eclipse Plus C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流动相为0.1%的甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，进行梯度洗脱(0～10 min，15%→57% B；10～15 min，57%→65% B)，柱温为30 ℃，检测波长为256，280，300，320，350 nm，流速为0.4 mL·min-1。

2.5 标准曲线的绘制

精密吸取混合对照品溶液1，2，3，4，5，6，7 μL，按“2.4”项下色谱条件测定，以对照品进样量X为横坐标，峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表1。

表1 5种成分的线性考察结果
Tab. 1 Linear results of the 5 components

成 分 线性回归方程 线性范围/μg r木蝴蝶苷B Y=5 975X-270.3 0.159～1.113 0.999木蝴蝶苷A Y=7 897X-338.1 0.167～1.169 0.999白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷Y=6 000X-16.11 0.061 3～0.4290.999黄芩素 Y=8 731X+15.42 0.034 6～0.2430.999白杨素 Y=12 633X+14.27 0.041 3～0.2890.999

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性试验 分别精密量取“2.3”项下混合对照品溶液、“2.2”项下供试品溶液(产地为云南昆明)和空白溶剂各0.5 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.4”项下色谱条件测定，采用Matlab 软件进行全时段多波长融合，得到全时段多波长融合指纹图谱，结果显示，溶剂对样品的分离无干扰，样品和混合对照品色谱峰分离度很好，其他色谱峰对含量测定无干扰。结果见图1。

图1 多波长融合色谱峰
A-空白溶液；B-供试品溶液；C-混合对照品；1-木蝴蝶苷B；2-木蝴蝶苷A；3-白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；4-黄芩素；5-白杨素。
Fig. 1 Full-time multi-wavelength fusion fingerprint of sample solution
A-blank solution; B-sample solution; C-mixed reference substance solution; 1-oroxin B; 2-oroxin A; 3-chrysin 7-O-β-D-glucuronic acid glycosides; 4-baicalein; 5-chrysin.

2.6.2 仪器精密度试验 取供试品溶液(产地为云南昆明)，按“2.4”项下色谱条件连续进样6次，计算各色谱峰相对峰面积和相对保留时间，计算RSD，各共有色谱峰相对保留时间的RSD＜0.19%，相对峰面积RSD＜2.82%，表明仪器精密度良好。

2.6.3 重复性试验 取同一产地(产地为云南昆明)经同一提取纯化方法进行提取纯化的木蝴蝶总黄酮，按照“2.2”项方法制备供试品溶液6份，按“2.4”项色谱条件对5种主要成分进行测定，计算各色谱峰相对峰面积和相对保留时间，计算RSD，各共有色谱峰相对保留时间的RSD均＜0.11%，相对峰面积RSD均＜2.56%，表明方法重复性良好。

2.6.4 稳定性试验 取供试品溶液(产地为云南昆明)，室温下放置，按“2.4”项下色谱条件分别于0，2，4，6，12，24 h进行测定，计算各色谱峰相对峰面积和相对保留时间，计算RSD，各共有色谱峰相对保留时间RSD＜0.08%，相对峰面积RSD＜2.44%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.6.5 加样回收率试验 取木蝴蝶总黄酮0.1 g (产地为云南昆明)，精密称定，置于50 mL量瓶中，加入3.01 mg·mL-1的木蝴蝶苷A对照品溶液10 mL，3.53 mg·mL-1的木蝴蝶苷B对照品溶液10 mL，4.52 mg·mL-1的白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对照品溶液2 mL，4.49 mg·mL-1的黄芩素对照品溶液2 mL，2.84 mg·mL-1的白杨素对照品溶液1 mL，用甲醇稀释至刻度，即为供试品溶液，制备供试品溶液6份，按“2.4”项下色谱条件进行测定，进样量为0.5 μL，计算回收率，结果见表2。

表2 各成分加样回收率结果
Tab. 2 The result of sample recovery rate

编号样品中含量/mg对照品加入量/mg测得量/ mg回收率/ %平均回收率/% RSD/ % 29.17 30.10 58.88 98.70木蝴蝶苷A 29.48 30.10 59.60 100.07 30.18 30.10 59.81 98.44 29.83 30.10 59.40 98.24 29.95 30.10 59.85 99.34 30.07 30.10 59.56 97.97 98.790.78 35.41 35.30 70.36 99.01木蝴蝶苷B 34.93 35.30 70.84 101.73 35.24 35.30 70.03 98.56 35.36 35.30 70.94 100.79 36.02 35.30 71.13 99.46 35.64 35.30 70.20 97.90 99.581.43 9.10 9.04 18.03 98.78白杨素7-O-β-D -葡萄糖醛酸苷8.89 9.04 17.68 97.23 8.64 9.04 17.46 97.57 9.16 9.04 18.09 98.78 9.22 9.04 18.18 99.12 8.92 9.04 18.08 101.11 98.771.39 9.09 8.98 17.86 97.66黄芩素8.45 8.98 17.27 98.22 8.85 8.98 17.74 99.00 9.12 8.98 17.92 98.00 9.01 8.98 17.84 98.34 8.90 8.98 18.06 102.00 98.871.63 2.81 2.84 5.60 98.24白杨素2.67 2.84 5.47 98.59 2.94 2.84 5.70 97.18 2.87 2.84 5.68 98.94 2.66 2.84 5.44 97.89 2.92 2.84 5.74 99.30 98.871.61

2.7 系统适用性试验

2.7.1 不同进样量各对照品的相对校正因子 精密吸取对照品溶液2，3，4，5，6，7 μL，以白杨素色谱峰为参照峰，按照“2.1”项下方法原理计算木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的相对校正因子[10-11]，结果见表3。

2.7.2 不同色谱柱条件下各对照品的相对校正因子 取“2.3”项下混合对照品溶液，使用不同型号的3根色谱柱，以白杨素色谱峰为参照峰，测得的木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的相对校正因子，结果见表4。

表3 不同进样量条件下各对照品的相对校正因子
Tab. 3 Relative correction factor of different sample quantity

注：fc/A为木蝴蝶苷A对白杨素的相对校正因子；fc/B为木蝴蝶苷B对白杨素的相对校正因子；fb/cg为白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对白杨素的相对校正因子；fc/b为黄芩素对白杨素的相对校正因子。Note： fc/Awas oroxin A relative correction factor to chrysin; fc/bwas oroxin B relative correction factor to chrysin; fc/cgwas chrysin 7-O-β-D-glucuronic acid glycosides relative correction factor to chrysin; fc/bwas baicalein relative correction factor to chrysin.

进样量/μLfc/Afc/Bfc/cgfc/b2 1.81 2.40 2.17 1.45 3 1.80 2.39 2.18 1.46 4 1.74 2.35 2.16 1.42 5 1.72 2.30 2.17 1.47 6 1.69 2.37 2.14 1.46 7 1.76 2.31 2.12 1.44平均值 1.75 2.35 2.16 1.45 RSD(%) 2.64 1.75 0.02 1.23

表4 不同色谱柱条件下的相对保留时间和相对校正因子
Tab. 4 Relative correction factor of different columns

组 分 Eclipse Plus C18(2.1 mm× 100 mm, 1.8 μm)相对校正因子Extebd C18(2.1 mm× 50 mm, 1.8 μm)相对校正因子Poroshell 120 C18(4.6 mm× 150 mm, 2.7 μm)相对校正因子RSD/%木蝴蝶苷A 1.74 1.69 1.72 1.47木蝴蝶苷B 2.35 2.41 2.37 1.29黄芩素 1.47 1.45 1.46 0.68白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷 2.14 2.15 2.17 0.71

2.7.3 不同仪器条件下各对照品的相对校正因子取“2.3”项下混合对照品溶液，使用不同型号高效液相色谱仪，以白杨素色谱峰为参照峰，测得的木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷的相对校正因子，结果见表5。

表5 不同仪器条件下各对照品的相对校正因子
Tab. 5 Relative correction factor of different instruments

仪 器 fc/Afc/Bfc/cgfc/bAgilent 1290 1.74 2.35 2.14 1.47 Agilent 1260 1.74 2.32 2.15 1.45 Agilent 1100 1.68 2.40 2.10 1.40平均值 1.72 2.36 2.13 1.44 RSD/% 2.02 1.71 1.24 2.50

一测多评法定位木蝴蝶苷A、木蝴蝶苷B、黄芩素、白杨素7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷相对保留时间分别为0.43，0.32，0.75，0.53；相对校正因子分别按1.74，2.35，1.47，2.14计算。

2.8 不同产地的木蝴蝶总黄酮的含量测定

精密称取不同产地的木蝴蝶总黄酮，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件进行测定，进样量为0.5 μL，根据标准曲线回归方程计算木蝴蝶总黄酮中5种主要成分的含量[12-15]，结果见表6。

由表6可知，不同产地木蝴蝶中5种主要成分分别采用外标法和一测多评法进行含量测定的结果并无显著性差异，说明一测多评法可以用于木蝴蝶多成分的含量测定。

3 讨论

本研究利用Matlab软件建立了中药木蝴蝶的全时段多波长融合指纹图谱，克服了单一波长检测指标信息不足的缺点，使中药木蝴蝶总黄酮中5个主要成分分别在各自紫外最大吸收波长下进行含量测定，使含量测定更加准确。

本研究建立了中药木蝴蝶“一测多评”的含量测定方法，以廉价易得的白杨素为指标，计算与其他对照品的相对校正因子，通过方法学考察、系统适用性考察、一测多评法的科学性与准确性考察，结果表明，一测多评与外标法所测得的结果无显著性差异，可以用于中药木蝴蝶的多指标质量评价，进一步验证了在缺少对照品的情况下，采用一测多评法对中药进行质量控制的科学性与可行性，为中药木蝴蝶质量的系统评价和全面的质量控制提供了完善的实验依据和理论基础。

表6 不同产地木蝴蝶中5种主要成分的含量
Tab. 6 Contents of five flavonoids compounds in Oxoxyli Semen mg·g-1

产地 白杨素 木蝴蝶苷A 木蝴蝶苷B 白杨素-7-O-β-D-葡萄糖酸苷 黄芩素外标法 一测多评法 外标法 一测多评法外标法 一测多评法 外标法 一测多评法广西 19.83 316.58 316.87 80.53 78.77 64.12 64.34 209.41 206.44贵州 31.31 304.40 304.36 74.77 73.21 92.37 92.61 239.59 239.37湖南 25.27 361.35 366.29 89.88 89.54 91.37 91.86 251.49 253.31四川 20.28 315.10 313.64 80.53 78.63 66.92 67.13 247.41 245.94昆明 26.08 325.61 326.28 83.68 82.16 83.59 84.60 268.23 269.71大理 21.65 299.36 298.08 74.99 73.10 64.10 62.58 196.21 191.80丽江 22.05 353.43 361.43 101.84 100.79 91.92 92.45 268.63 275.70亳州 23.24 306.96 305.40 77.63 75.91 66.59 67.84 200.84 195.49

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Simultaneous Quantitative Determination of Five Active Chemical Compositions in Oroxyli Semen by QAMS Based on Full-time Multi-wavelength Fusion Method

LI Nannan1, MENG Xiansheng1,2,3*, BAO Yongrui1,2,3, WANG Shuai1,2,3, LI Tianjiao1,2,3
(1.School of Pharmacy, Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Dalian 116600, China; 2.Component Medicine Engineering Research Center of Liaoning Province, Dalian 116600, China; 3.Liaoning Province Modern Chinese Medicine Research Engineerig Laboratory, Dalian 116600, China)

ABSTRACT：OBJECTIVE To established a quantitative analysis of multi-components with a single marker (QAMS) method for simultaneous quantitative analysis of the five flavonoids in Oroxyli Semen based on full-time multi-wavelength fusion.METHODSWith UPLC methods, Eclipse Plus C18column(2.1 mm×100 mm, 1.8 μm) was used, the mobile phase was 0.1% methanoic acid in water (A) and acetonitrile (B) with gradient elution (0-10 min, 15%→57%B; 10-15 min, 57%→65%B). The detection wavelengths were 256, 280, 300, 320 and 350 nm. The flow rate of the mobile phase was 0.4 mL·min-1and the temperature was 30 . ℃RESULTSThe ruggedness of relative correction factor was assayed and data obtained from the two methods (ESM and QAMS) were compared, and no statistically significant difference was observed, which indicated that the new approached was applicable in the quantitative analysis of Oroxyli Semen.CONCLUSIONA new method is established for simultaneous quantitative determination of five bioactive flavonoids from traditional Chinese medicine Oroxyli Semen by combining full-time multi-wavelength fusion with QAMS, through applicability experiment. The method is simple, accurate and reliable, which is suitable for the quality evaluation of Oroxyli Semen.

KEY WORDS：Oroxyli Semen; QAMS; relative correction factor; quantitative determination

中图分类号：R284.1

文献标志码：A

文章编号：1007-7693(2017)07-0943-05

DOI：10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.07.003

引用本文：李楠楠, 孟宪生, 包永睿, 等. 基于全时段多波长融合指纹图谱的“一测多评”法测定中药木蝴蝶总黄酮中5种主要成分[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(7)： 943-947.

收稿日期：2016-12-02

(本文责编：李艳芳)

基金项目：“重大新药创制”国家科技重大专项(2013ZX09507005001-004)

作者简介：李楠楠，女，博士生 Tel： (0411)85890185 E-mail： linannan-999@163.com*

通信作者：孟宪生，男，教授，博导 Tel：(0411)85890185 E-mail： mxsvvv@163.com