流动注射化学发光测定硫酸阿米卡星

慕苗1，高娟2，亢玉红1，高平强1(1.榆林学院化学与化工学院，陕西榆林 719000；2.榆林市药品检验所，陕西榆林 719000)

摘要：目的建立测定注射液中硫酸阿米卡星的新方法。方法采用高灵敏度的化学发光分析法，结合流动注射技术，测定药物制剂中硫酸阿米卡星的含量。通过单因素试验和正交试验对鲁米诺、高锰酸钾及氢氧化钠3因素进行优化。结果该化学发光体系的最优条件：鲁米诺溶液浓度为5.0×10-4mol·L-1、高锰酸钾溶液浓度为1.0×10-5mol·L-1、氢氧化钠浓度为0.1 mol·L-1。硫酸阿米卡星浓度在1.0×10-8～1.0×10-6g·mL-1内与相对化学发光强度成良好线性关系，相关系数为0.991 7，检出限为7.5×10-9g·mL-1。在体系最佳条件下，对浓度为1.0×10-7g·mL-1的硫酸阿米卡星溶液平行测定11次，RSD为2.4%，回收率均＞96%。结论该法简便快速，结果准确可靠，可用于注射液中硫酸阿米卡星的含量测定。

硫酸阿米卡星(amikacin sulfate，AMK)是一种半合成的氨基糖苷类抗菌药物，用于治疗妥布霉素和卡那霉素抗性菌株及革兰阴性杆菌的严重感染[1]。长期或过量使用AMK会引起不良反应，损害肾脏和听觉。因此，建立检测AMK含量的测定方法对药品安全监督和临床使用具有重要的实际意义。目前已报道测定AMK的检测方法有分光光度法[2]、瑞利散射法[3]、HPLC[4-5]、荧光法[6]、离子色谱法[7]等。

化学发光分析法因其具有设备简单、线性范围宽、灵敏度高、无背景干扰等优点而备受人们关注。流动注射化学发光法作为一种有效的痕量分析技术，为药物分析提供了很好的手段，已广泛应用于医药、生物、食品、微生物、环境分析等领域[8-9]。利用化学发光分析法测定AMK的含量也有报道，但其检出限较高[10]。基于AMK在碱性条件下对鲁米诺-高锰酸钾化学发光体系的化学发光信号有强烈的增敏作用，本研究结合流动注射技术建立了一种直接测定AMK的流动注射化学发光新方法，并采用正交试验优选出最佳测定条件，为AMK的测定提供客观的实验依据。

1 仪器、试剂

IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限公司)；IFFS-A型多功能化学发光检测器(西安瑞迈分析仪器有限公司)；FA1004型电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)。

鲁米诺(南京奥多福尼生物科技有限公司，批号：20140704)；高锰酸钾(成都市科龙化工试剂厂，批号：20090513)；AMK(中国食品药品检定研究院，批号：1401025，纯度：99.6%)；AMK注射液(齐鲁制药有限公司，批号：2121741FA，规格：2 mL∶0.2 g)；氢氧化钠(天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：20140407)。

2 方法

①鲁米诺标准溶液(1.0×10-2mol·L-1)：准确称取鲁米诺0.442 9 g，用0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶解并定容于250 mL棕色量瓶中，混匀避光保存，1周后使用。②高锰酸钾标准溶液(1.0× 10-2mol·L-1)：准确称取0.158 0 g高锰酸钾，用二次蒸馏水溶解并定容于100 mL量瓶中，在半个月内使用。③氢氧化钠标准溶液(0.1 mol·L-1)：准确称取氢氧化钠2 g，用二次蒸馏水溶解并定容于500 mL量瓶中，静置后使用。④AMK标准液(1.0×10-3g·mL-1)：准确量取1 mL(约1 g)AMK溶液用二次蒸馏水溶解并定容于1 000 mL量瓶中，用时逐级稀释，现配现用。

流动注射化学发光流程见图1。a、b、c、d 4个管道分别进高锰酸钾溶液、AMK样品或空白溶液、水和鲁米诺溶液。将高锰酸钾与AMK混合后，由水载流再与鲁米诺溶液混合进入检测系统进行检测。以水作空白测得化学发光强度为I0，待基线稳定后将一定浓度的AMK样品溶液注入，测得其化学发光强度为Is。以相对化学发光强度ΔI=(Is－I0)与质量浓度(c)的线性关系进行定量。

图1 流动注射化学发光流路图
P1、P2-蠕动泵；V-进样阀；C-流通池；PMT-光电倍增管；NHV-负高压；PC-电脑；W-废液；a-高锰酸钾溶液；b-样品或空白样品；c-载流水；d-鲁米诺。
Fig. 1 Flow injection chemiluminescence flow chart
P1, P2-pump, V-valve; C-flow cell; PMT-photomultiplier tube; NHV-negative high voltage; PC-personal computer; W-waste; a-KMnO4solution; b-sample solution or blank solution; c-water; d-luminol solution.

2.3.1 氢氧化钠浓度对化学发光强度的影响在高锰酸钾浓度为 1.0×10-6mol·L-1、鲁米诺浓度为1.0×10-5mol·L-1、AMK 浓度为 1.0×10-6mol·L-1的条件下，按“2.2”项下方法考察浓度为 0.01，0.03，0.05，0.07，0.1，0.2，0.3，0.4 mol·L-1的氢氧化钠对相对化学发光强度的影响。

2.3.2 鲁米诺浓度的影响在高锰酸钾浓度为1.0×10-6mol·L-1、氢氧化钠浓度0.1 mol·L-1、AMK 浓度为 1.0×10-6mol·L-1的条件下，按“2.2”项下方法考察 1.0×10-5～9.0×10-4mol·L-1的鲁米诺对相对化学光强度的影响。

2.3.3 高锰酸钾浓度的影响在氢氧化钠浓度0.1 mol·L-1、鲁米诺浓度为1.0×10-5mol·L-1、AMK浓度为 1.0×10-6mol·L-1的条件下，按“2.2”项下方法考察浓度为1.0×10-6～5.0×10-5mol·L-1高锰酸钾对相对化学发光强度的影响。

以单因素实验结果为基础，选取高锰酸钾浓度、氢氧化钠浓度以及鲁米诺浓度3个因素设计正交试验，每个因素选3个水平，见表1。

表1 正交试验因素水平表
Tab. 1 Factors and levels of orthogonal test mol·L-1

3 结果与讨论

在碱性介质中，鲁米诺与高锰酸钾溶液混合后产生微弱化学发光，加入AMK溶液后，化学发光强度随着AMK溶液浓度的增大而大大增强。由此可见，AMK溶液加入鲁米诺-高锰酸钾体系的化学发光有较强增强作用，加入样品2 s后，体系的化学发光强度达到最大值，4 s化学发光强度回落到基线，表明该体系的发光为快速发光，基于此作用建立检测AMK的流动注射化学发光新方法。

考察溶液的不同混合方式对体系发光强度的影响，实验结果表明：按照如图1所示实验时，AMK对鲁米诺-高锰酸钾体系的发光强度大且增敏效果明显，故本实验选择该流路进行分析。

图2 化学发光动力学曲线
1-鲁米诺-高锰酸钾-1.0×10-6g·mL-1AMK；2-鲁米诺-高锰酸钾-1.0×10-9g·mL-1AMK；3-鲁米诺-高锰酸钾-水。
Fig. 2 The kinetic curves of CL reactions
1-luminol-KMnO4-1.0×10-6g·mL-1AMK; 2-luminol-KMnO4-1.0×10-9g·mL-1AMK; 3-luminol-KMnO4-H2O.

实验表明，在固定其他实验条件不变情况下，泵速对发光的影响主要是在峰形方面，对于发光强度影响相对较小。结合发光强度，峰形，重复性，运行时间等多个因素，最终确定主泵转速为65 r·min-1，副泵转速为40 r·min-1，采样速度为每次40 s。

实验结果显示：在碱性介质中，鲁米诺-高锰酸体系有较强化学发光信号，反应介质浓度和氧化剂浓度、还原剂浓度对发光强度有很大影响，根据不同浓度范围的考察，选择0.2 mol·L-1氢氧化钠，鲁米诺的浓度为 5.0×10-4mol·L-1高锰酸钾的浓度为1.0×10-5mol·L-1为优化条件，结果如图3。

在所选因素水平下，3个因素的最佳组合为A3B1C2(高锰酸钾浓度为5.0×10-5mol·L-1，氢氧化钠浓度0.1 mol·L-1，鲁米诺浓度5.0×10-4mol·L-1)。通过极差R的大小分析可知，各实验因素对相对化学发光强度影响程度不同，主次顺序为：C＞A＞B，即：鲁米诺浓度对AMK化学发光强度的影响最大，高锰酸钾浓度次之，氢氧化钠浓度对实验结果的影响最小。结果见表2。

在体系最佳条件下，AMK浓度在1.0×10-8～1.0×10-6g·mL-1内与体系的相对化学发光强度呈良好的线性关系，线性方程为y=236.62x+4 563.6，即ΔI=2.366 2×10-5C+4 563.6，相关数系为0.991 7。根据IUPAC规定，计算本方法的检出限(3σ)为7.5×10-9g·mL-1。在体系最佳条件下，对浓度为1.0×10-7g·mL-1的AMK溶液平行测定11次，RSD为2.4%，表明该方法测定AMK精密度良好。

图3 氢氧化钠、鲁米诺、高锰酸钾浓度对相对化学发光强度的影响
Fig. 3 Effects of sodium hydrate,luminol,potassium hypermanganate concentrations on ΔI

表2 流动注射化学发光法测定硫酸米卡星的正交试验结果
Tab. 2 The orthogonal experiment results for the determination of amikacin sulfate by FI-CL

将同一浓度AMK溶液分别于0，2，4，6，8，16，24 h重复测定相对化学发光强度，其RSD为1.9%，表明AMK在24 h内测定结果稳定。

按样品测定“1.3”项下的方法，对同一批号样品取样平行测定5次，求得AMK含量9.6× 10-8g·mL-1，RSD为2.3%，表明方法重复性较好。

取市售同一批AMK注射液5支，去包装后混匀，精密称取5份0.5 mg的AMK，分别加入0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mLAMK标准液加水定容于100 mL的量瓶中，摇匀。按“1.3”项下方法进行含量测定，平均回收率(n=5)为98.7%，RSD为2.1%，结果见表3。

取市售同一批AMK注射液5支去包装后，精密量取0.1 mL样品(相当于10 mg的AMK)，加水定容至100 mL，摇匀。取适量逐级稀释至线性范围内，在选定的最佳条件下按“2.2”项下的方法进行测定，并计算得AMK含量为标示量99.6%，RSD为2.8%。

表3 AMK回收率试验(n=5)
Tab. 3 The recovery experiment of AMK(n=5)

4 小结

基于AMK对鲁米诺与高锰酸钾之间的化学发光反应具有显著的增敏作用，本研究建立了测定AMK的流动注射化学发光的分析方法，提高了AMK测定的灵敏度。该方法与HPLC等方法相比具有简单、快速等特点，可用于药物制剂中的AMK含量的测定，结果与标示量基本一致。

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MU Miao1, GAO Juan2, KANG Yuhong1, GAO Pingqiang1
(1.Chemistry and Chemical Engineering Department, Yulin College, Yulin 719000, China; 2.Yulin Institute for Drug Control, Yulin 719000, China

)

ABSTRACT：OBJECTIVE To establish the new method of detecting amikacin sulfate injection.METHODSThe optimal chemiluminescence of experiment were determined by chemiluminescence coupled with flow injection. Three effects of luminol, potassium permanganate, sodium hydroxide were inverstigated using single-factor and orthogonal experiments.RESULTSThe optimal conditions for amikacin sulfate determanation were as follows： Luminol 5.0×10-4mol·L-1, potassium permanganate 1.0×10-5mol·L-1, sodium hydroxide 0.1 mol·L-1. Under the optimum experimental conditions, the relative chemiluminescence intensity was linearly related to the concentration of amikacin sulfate from 1.0×10-8-1.0×10-6g·mL-1(r=0.991 7). The detection limit of amikacin sulfate was 7.5×10-9g·mL-1(3σ), with RSD of 2.4% for 11 determinations of 1.0×10-7g·mL-1amikacin sulfate. The recovery rates were ＞96%.CONCLUSIONThe proposed method is simple and accurate. The result is satisfactory. It can be used to determine the content of amikacin sulfate injection.

引用本文：慕苗, 高娟, 亢玉红, 等. 流动注射化学发光测定硫酸阿米卡星[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(7)： 948-951.

基金项目：国家质量监督检验检疫总局科技计划项目(2014QK132)；陕西省教育厅专项研究计划(16JK1891)

作者简介：慕苗，女，硕士生，实验师 Tel： (0912)3891144 E-mail： mumiao521@163.com