三七主要皂苷类药效成分含量的近红外光谱测定法

朱捷强，杨振中*(浙江大学药学院中药科学与工程学系，杭州 310058)

摘要：目的 建立基于近红外光谱快速测定三七药材中5种主要皂苷类药效成分含量的方法。方法取173批不同部位、不同产地、不同大小规格的三七药材，采用HPLC定量分析方法测定三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd的含量，作为参考值。药材粉碎后在4 000～10 000 cm-1波数范围内采集光谱，对光谱预处理方法、建模波段及主成分数进行优选，采用偏最小二乘回归算法建立近红外光谱与三七药材中5种主要药效成分含量HPLC分析结果之间的多元校正模型。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd在校正模型中的预测相关系数(r)分别为0.959 6，0.978 5，0.902 6，0.966 0和0.992 9。结论该方法测定的5种皂苷是三七的主要药效成分，且为三七总皂苷类制剂的质量检测指标。本方法操作简便快速，结果准确，可用于三七药材质量的快速检测。

关键词：近红外光谱；三七；皂苷；偏最小二乘回归

在血塞通等三七总皂苷类制剂中，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Re、Rb1和Rd是其主要药效成分[1]，同时也是该类制剂的质检指标。三七药材中这5种药效成分的含量对三七总皂苷类制剂终产品的质量有重要影响，一般通过HPLC定量分析方法测定。虽然HPLC检测结果准确度较高，但样品预处理方法繁琐，分析周期较长，检测效率不高，且需要相关对照品。近年来，近红外光谱技术作为一种无损的快检技术，在中药领域被广泛应用，包括药材质量检验[2]，中成药产品质量检验[3]和中药制药过程质量监测[4]等。

杨南林等[5]采用近红外光谱建立了三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1、Rd及三七总皂苷的定量分析方法。之后，通过神经网络等非线性方法建模，在一定程度上改善了预测效果[6]。本研究扩大样本量及样本代表性(包括不同部位、不同产地及不同大小规格样品)，建立对三七药材中5种主要药效成分同时检测的近红外光谱分析方法，可用于血塞通等三七总皂苷类制剂所用，三七药材中药效成分含量的快速检测，为三七总皂苷类制剂的生产提供参考。

1 材料与仪器

收集三七不同部位(包括主根、剪口、筋条、须根等)、不同产地(包括文山州、红河州、昆明市、玉溪市等)、不同大小规格的药材用于本研究。药材经由浙江大学药学院陈柳蓉副教授鉴定。由于采用积分球漫反射方式采集近红外光谱需要一定量的三七药材粉末，取药材量符合要求的173批药材，用于建立近红外光谱定量模型。三七药材粉碎后过280 μm筛，待用。

三七皂苷R1(NG-R1)、人参皂苷Rg1(G-Rg1)、Re(G-Re)、Rb1(G-Rb1)和Rd(G-Rd)均购自上海融禾医药科技发展有限公司，纯度≥98%；乙腈和甲醇为色谱纯(Merck公司)；去离子水由Milli-Q系统(Millipore公司)制得；其余试剂均为分析纯。

Antaris MX傅里叶变换近红外光谱仪(Thermo公司)，配备积分球漫反射采样装置和RESULT 3.0光谱采集软件。Agilent 1100系列HPLC系统(美国Agilent公司)，配有四元溶剂泵、自动进样器、柱温箱、可变波长紫外光检测器。

2 方法

2.1 近红外光谱采集

近红外光谱采集条件：波数范围为4 000～10 000 cm-1，扫描次数64次，分辨率4 cm-1，以空气为背景。采集的光谱见图1。

图1 三七药材粉末的近红外漫反射光谱
Fig. 1 The original NIR spectra of the powder of Panax notoginseng

2.2 参照分析方法

三七药材中5种主要皂苷类药效成分定量分析采用笔者前期建立的方法[7]。Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm×50 mm，1.8 μm)；流动相：水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～22 min，17%→19% B；22～30 min，19%→27% B；30～35 min，27% B；35～47 min，27%→46% B；47～70 min，46%→90% B)；检测波长：203 nm；进样体积：3 μL；流速：0.8 mL·min-1；柱温：35 ℃。典型的HPLC图见图2。

图2 三七药材高效液相色谱图
1-NG-R1；2-G-Rg1；3-G-Re；4-G-Rb1；5-G-Rd。
Fig. 2 HPLC chromatogram of Panax notoginseng
1-NG-R1; 2-G-Rg1; 3-G-Re; 4-G-Rb1; 5-G-Rd.

2.3 数据处理

根据Chauvenet检验剔除光谱异常样本，然后随机划分校正集和验证集。分别对光谱预处理方法和建模波段进行优选后，以交叉验证均方根误差(RMSECV)为指标确定最佳主成分数。采用偏最小二乘回归(partial lease squares regression，PLSR)方法建立定量校正模型，以预测相关系数(r)，校正集均方根误差(RMSEC)和验证集预测均方根误差(RMSEP)为指标评价模型预测性能。数据处理软件为TQ Analyst(V 8.0)。

3 结果与讨论

3.1 定量校正模型的建立

3.1.1 样本的分布 共173组三七样本，根据Chauvenet检验，剔除5组异常样本，其余样本随机划分为校正集152组、验证集16组。HPLC定量分析方法结果汇总显示，校正集和验证集中各药效成分浓度分布相似，都能很好地反映整体样本的药效成分含量情况，结果见表1。

3.1.2 光谱预处理方法选择 为了除去近红外光谱中的噪音和干扰，采用全波段PLSR建模，分别比较了多种光谱预处理方法，结果显示一阶导数对5种药效成分预测结果较好，结果见表2。3.1.3 光谱波段的选择 虽然PLSR法可以在一定程度上消除光谱的共线性，但仍然有必要对建模波段进行优化。通过比较不同波段的建模效果，优选建模光谱波段，结果显示，5种药效成分皆以全波段建模最优，结果见表3。

3.2 主成分数的确定

本研究根据RMSECV判断PLSR建模的主成分数。G-Rd定量模型的主成分数和RMSECV关系见图3。当主成分数为8时，RMSECV趋于稳定，故选择G-Rd定量模型的主成分数8个。同法可得NG-R1、G-Rg1、G-Re和G-Rb1的主成分数分别为7，7，6和7个。

表1 校正集和验证集中皂苷成分含量分布情况
Tab. 1 Saponin contents of samples in the calibration set and validation set mg·g-1

皂苷 样品 样品数平均值 最小值 最大值区间NG-R1校正集152 11.1 4.4 21.0 16.6验证集16 9.4 5.5 18.7 13.2 G-Rg1校正集152 36.9 20.9 57.8 36.9验证集16 36.5 19.8 53.8 34.0 G-Re校正集152 5.1 2.0 9.5 7.5验证集16 5.2 1.8 8.1 6.3 G-Rb1校正集152 30.2 14.9 47.0 32.1验证集16 32.2 21.3 48.4 27.1 G-Rd校正集152 8.9 3.7 15.8 12.1验证集16 9.1 4.8 15.2 10.4

表2 NG-R1、G-Rg1、G-Re、G-Rb1和G-Rd光谱预处理结果的比较
Tab. 2 The comparison of different spectra pretreat methods of NG-R1, G-Rg1, G-Re, G-Rb1and G-Rd

预处理方法NG-R1光谱 G-Rg1光谱 G-Re光谱 G-Rb1光谱 G-Rd光谱r RMSEC/ mg·g-1RMSEP/ mg·g-1r RMSEC/ mg·g-1RMSEP/ mg·g-1r RMSEC/ mg·g-1RMSEP/ mg·g-1r RMSEC/ mg·g-1RMSEP/ mg·g-1r RMSEC/ mg·g-1RMSEP/ mg·g-1未处理 0.730 2 2.68 2.63 0.917 0 3.65 4.81 0.634 91.26 1.42 0.868 53.54 2.56 0.922 2 1.15 1.02一阶导 0.959 6 1.11 2.55 0.978 5 1.89 3.73 0.902 60.70 1.46 0.966 01.85 2.89 0.992 9 0.35 1.10二阶导 0.759 1 2.56 3.07 0.998 8 0.45 7.16 0.691 11.17 1.44 0.655 85.40 5.71 0.954 1 0.89 2.43 SG+一阶导 0.875 4 1.90 2.72 0.928 7 3.40 3.62 0.773 41.03 1.28 0.928 32.66 2.84 0.946 9 0.96 0.87 SG+二阶导 0.896 4 1.74 2.78 0.943 2 3.04 3.15 0.825 80.92 1.27 0.930 12.63 2.57 0.953 6 0.89 0.94 MSC 0.744 3 2.62 2.24 0.929 2 3.39 4.18 0.665 81.21 1.52 0.827 04.02 2.99 0.919 8 1.17 1.09 SNV 0.746 2 2.61 2.21 0.902 2 3.95 5.88 0.599 81.30 1.44 0.823 74.05 2.98 0.918 2 1.18 1.14

表3 NG-R1、G-Rg1、G-Re、G-Rb1和G-Rd波段建模效果比较
Tab. 3 The comparison of different wavelength regions of NG-R1, G-Rg1, G-Re, G-Rb1and G-Rd

波段范围/cm-1NG-R1波段 G-Rg1波段 G-Re波段 G-Rb1波段 G-Rd波段r RMSEC/ mg·g-1RMSEP/ mg·g-1r RMSEC/ mg·g-1RMSEP/ mg·g-1r RMSEC/ mg·g-1RMSEP/ mg·g-1r RMSEC/ mg·g-1RMSEP/ mg·g-1r RMSEC/ mg·g-1RMSEP/ mg·g-1全波段 0.959 6 1.11 2.55 0.978 5 1.89 3.73 0.902 60.70 1.46 0.966 01.85 2.89 0.992 9 0.35 1.10 9 989～7 436 0.732 0 2.68 2.97 0.758 0 5.98 7.57 0.576 91.33 1.38 0.598 85.72 6.54 0.770 2 1.89 2.37 7 436～6 888 0.873 6 1.91 2.70 0.983 2 1.67 6.77 0.759 51.06 1.47 0.847 83.79 4.21 0.932 4 1.07 1.79 6 888～5 602 0.755 3 2.57 2.21 0.972 8 2.12 4.16 0.801 30.97 1.28 0.927 92.66 2.85 0.959 6 0.84 1.04 5 602～5 172 0.885 9 1.82 2.33 0.926 4 3.45 4.51 0.863 30.82 1.37 0.793 24.35 4.87 0.791 8 1.81 2.00 5 172～4 000 0.856 5 2.03 2.51 0.945 4 2.99 3.60 0.855 80.84 1.04 0.950 72.22 3.08 0.954 2 0.89 0.91 7 181～5 193 0.820 4 2.25 2.27 0.963 1 2.46 4.07 0.871 50.80 1.45 0.964 71.88 2.83 0.965 1 0.78 1.02

图3 G-Rd定量模型中不同主成分数的RMSECV
Fig. 3 RMSECV values under different principal components of G-Rd

3.3 模型预测结果

在选定的最优光谱预处理、波段及主成分数条件下，预测三七中主要皂苷类药效成分含量，各个回归模型的预测值和参考值之间的相关图见图4。三七中5种主要皂苷类药效成分的预测值与参考值均高度相关。同时，5种皂苷成分在较宽的含量区间内呈现了相近的预测能力，说明该方法可以在不同皂苷含量的三七药材中使用。

本研究建立了一种面向三七主要皂苷类药效成分的近红外光谱含量快速测定方法。本方法操作简便、预测性能良好，5种主要药效成分(NG-R1、G-Rg1、G-Re、G-Rb1和G-Rd)的预测相关系数均＞0.9。而且，检测指标与三七总皂苷类制剂的质检指标一致，增加了本方法的实用性。该方法适合在三七总皂苷类制剂生产线旁快速准确地获取投料药材的含量信息，为制剂的生产提供参考。同时，该方法也可以用于三七药材采购阶段的质量检测。

图4 NG-R1(A)、G-Rg1(B)、G-Re(C)、G-Rb1(D)和G-Rd(E)的预测值与参考值相关图
Fig. 4 Correlation diagrams between the NIR predicted values and the reference values of NG-R1(A), G-Rg1(B), G-Re(C), G-Rb1(D) and G-Rd(E)

REFERENCES

[1] YANG Z, SHAO Q, GE Z, et al. A bioactive chemical markers based strategy for quality assessment for botanical drugs： Xuesaitong injection as a case study [J]. Sci Rep, 2017, 7(1)： 2410.

[2] GEN S, CHEN Y, JIN Y, et al. Rapid quantitative determination of multi-indicators in Lonicerae Japonicare Flos by near-infrared spectroscopy [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2016, 33(2)： 144-150.

[3] SUN S B, CHEN X Y, GAO H, et al. Rapid analysis of the quality of formula granule of stir-baked gardenia fructus formula from different manufacturers by near-infrared spectroscopy [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2015, 32(8)： 960-963.

[4] NI K L, WU C Y, LIU X S. Quantitative analysis of total solid content in lixivating process of Shuxuetong injection using near-infrared spectroscopy [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2015, 32(8)： 970-975.

[5] YANG N L, CHENG Y Y, WU Y J. A new method for fast and nondestructive analysis of saponins in Panax notoginseng herb by near infrared spectroscopy [J]. Acta Chim Sinica(化学学报), 2003, 61(3)： 393-398.

[6] 刘雪松. 中药的近红外光谱计算分析方法学研究[D]. 杭州： 浙江大学, 2005.

[7] ZHU J Q, FAN X H, CHENG Y Y, et al. Chemometric analysis for identification of botanical raw materials for pharmaceutical use： a case study using Panax notoginseng [J]. PloS One, 2014, 9(1)： e87462.

Rapid Quantitative Determination of Main Saponin Constituents in Panax Notoginseng by Near-infrared Spectroscopy Technique

ZHU Jieqiang, YANG Zhenzhong*
(Department of Chinese Medicine Science ＆ Engineering, College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

ABSTRACT：OBJECTIVE To establish a rapid quantitative method for determining main saponin constituents in Panax notoginseng by near-infrared spectroscopy (NIR).METHODSA total of 173 batches of Panax notoginseng samples with different sizes, from different parts and geographical regions were collected, and the contents of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, Re, Rb1and Rd as reference were quantitatively determined by HPLC. The crushed samples of Panax notoginseng were used to obtain the NIR spectra of 4 000-10 000 cm-1. Model parameters including pretreatment of spectra, wavelength range and PLS factors were optimized. Partial least squares regression (PLSR) was employed to establish the calibration models between the spectra and the contents of main active constituents, respectively.RESULTSIn the constructed PLS models, the values of correlation coefficient (r) of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, Re, Rb1and Rd were 0.959 6, 0.978 5, 0.902 6, 0.966 0 and 0.992 9, respectively.CONCLUSIONThe constituents determined by this method are the main active constituents of Panax notoginseng, which are also the quality assessment markers for the preparations derived from the total saponins of Panax notoginseng. The proposed method is rapid, convenient and accurate, which can be used for the rapid analysis of the main active constituents in Panax notoginseng.

KEY WORDS：near-infrared spectroscopy; Panax notoginseng; saponins; partial least squares regression

中图分类号：R284.1；R917.101

文献标志码：B

文章编号：1007-7693(2017)07-1007-04

DOI：10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.07.016

引用本文：朱捷强, 杨振中. 三七主要皂苷类药效成分含量的近红外光谱测定法[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(7)：1007-1010.

收稿日期：2016-09-19

(本文责编：蔡珊珊)

基金项目：“重大新药创制”国家科技重大专项(2014ZX09201022-009)

作者简介：朱捷强，男，博士 Tel： 13588172465 E-mail： zhujieqiang@foxmail.com*

通信作者：杨振中，男，博士，助理研究员 Tel：(0571)88208426 E-mail： yangzz@zju.edu.cn