余 琪，毛培江，姜建民，金祖汉 *(浙江省中药研究所，杭州 310023)
摘要：目的 比较铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛4种药用石斛对增强小鼠免疫功能的效果。方法 4种石斛以0.25，0.50 g·kg -1连续给予正常小鼠30 d后，测定小鼠的T淋巴细胞增殖能力、巨噬细胞吞噬率和吞噬指数；4种石斛以0.25，0.50 g·kg -1连续给予受环磷酰胺免疫抑制的小鼠30 d后，显微镜下用细胞计数法计数免疫抑制小鼠血液中的白细胞数、淋巴细胞数和中性粒细胞数。结果 4种石斛0.25，0.50 g·kg -1剂量均能显著增强T淋巴细胞增殖能力，并显著增加血液中的淋巴细胞数和巨噬细胞吞噬指数；铁皮石斛0.25，0.50 g·kg -1剂量均能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬率、血液中的白细胞数、中性粒细胞数；鼓槌石斛和流苏石斛0.50 g·kg -1剂量能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬率和血液中的白细胞数；金钗石斛0.50 g·kg -1剂量能显著升高血液中的白细胞数。结论 4种石斛均能增强小鼠免疫功能，但铁皮石斛在增强巨噬细胞吞噬能力及提高免疫抑制小鼠血液中的中性粒细胞数方面效果优于另外3种石斛。
关键词：铁皮石斛；金钗石斛；鼓槌石斛；流苏石斛；免疫功能
石斛(Dendrobium)属于兰科植物，全球有1 500多种，中国有近80种。中国石斛属植物中被认定有药用价值的种类已超过50多种 [1]。中国药典2015年版将铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)列为单独一味中药材 [2]，而石斛除明确基源的3种原植物金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)、鼓槌石斛(Dendrobium chrysotoxum Lindl.)和流苏石斛(Dendrobium fimbriatum Hook.)外，还包括同属近似种 [2-3]。石斛的主要功效为益胃生津，滋阴清热。现代药理研究表明，石斛有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血脂等药理作用 [4-7]。不同石斛之间的药理作用的比较，目前并没有系统研究。本研究对铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛4种药典记载的石斛进行了增强免疫功能效果的比较。
1.1 药品及试剂
铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛4种药材均购自安徽亳州中药材市场，并经浙江省中药研究所教授级高工王志安鉴定，其中铁皮石斛产地为浙江，金钗石斛产地为安徽，鼓槌石斛和流苏石斛产地为云南，均为2年生石斛的茎；Hanks液(批号：15012602)、RPMI1640培养液(批号：15022601)、2倍Hanks液(批号：15030502)均购自吉诺生物医药技术有限公司；ConA(批号：021M8700V，P-Code：1001630796，美国Sigma)。白细胞稀释液：2%冰乙酸2 mL，10 g·L -1结晶紫3滴，加蒸馏水至100 mL。
1.2 仪器
LD5-2型离心机(北京医用离心机厂)；M200 pro酶标仪(意大利Tecan)；NU-5810E二氧化碳培养箱(美国Nuaire)。
1.3 动物
ICR小鼠，体质量18～22 g，清洁级，♀♂，浙江省实验动物中心提供。浙江省中药研究所实验动物使用许可证号：SYXK(浙)2013-0188。
2.1 石斛样品的处理
取铁皮石斛100 g，加8倍水煎煮2次，每次30 min，过滤，滤液浓缩至生药浓度为0.1 g·mL -1；临用前加蒸馏水稀释成0.05，0.025 g·mL -1，4 ℃冰箱保存，同法处理金钗石斜、鼓槌石斛和流苏石斛样品。
2.2 促进T淋巴细胞增殖试验 [8-9]
当T淋巴细胞受Con A刺激后母细胞发生增殖反应，活细胞(特别是增殖细胞)中的线粒体水解酶可将MTT分解为兰紫色结晶，其光密度值能反应细胞的增殖情况，光密度值越大，T淋巴细胞增殖能力越强。
90只ICR小鼠，♂，随机分为9组，每组10只，分别为对照组，铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛的高、低剂量组。8个石斛组中，高、低剂量组小鼠分别给予相应的石斛提取液0.50，0.25 g·kg -1，对照组小鼠给予等容积生理盐水，给药容积均为10 mL·kg -1。每天灌胃给药1次，连续给药30 d。末次给药后30 min脱颈椎处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，用镊子轻轻撕碎，制成单细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤，计数，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为3×10 6·mL -1。将细胞悬液分2孔加入24孔培养板中，每孔1 mL。一孔加75 μL ConA液，另一孔不加ConA液作为对照，每孔同时做3个平行孔，置于37 ℃、5% CO 2培养箱中培养72 h。培养结束前4 h，每孔轻轻吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT 50 μL。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解，在酶标仪上测定OD值，计算加ConA孔吸光度与不加ConA孔吸光度的差值。
2.3 对小鼠巨噬细胞吞噬能力的比较 [8-9]
ICR小鼠90只，♀，随机分为9组，每组10只，分别为对照组，铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛的高、低剂量组。8个石斛组中，高、低剂量组小鼠分别给予石斛提取液0.50，0.25 g·kg -1，对照组小鼠给予等容积生理盐水，给药容积均为10 mL·kg -1，每天灌胃给药1次，连续给药30 d。末次给药后30 min，每鼠腹腔注射20%鸡红细胞悬液1 mL，30 min后颈椎脱臼处死小鼠，将其仰位固定于鼠板上，剪开腹壁皮肤，经腹腔注入生理盐水2 mL，转动鼠板1 min，然后吸出腹腔洗液1 mL，平均分滴于2片玻片上，放入垫有湿纱布的平盘内，37 ℃温箱孵育30 min，孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞，晾干，以丙酮-甲醇(1∶1)溶液固定，4% Giemsa磷酸缓冲液染色3 min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数及被吞噬的鸡红细胞总数。每张片观察100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数。
2.4 对免疫抑制小鼠血液中白细胞数、淋巴细胞数的影响 [4,10]
ICR小鼠100只，随机分为10组，每组10只，♀♂各半，分别为对照组，模型组，铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛的高、低剂量组。8个石斛组中，高、低剂量组小鼠分别给予相应的石斛提取液0.50，0.25 g·kg -1，对照组和模型组小鼠给予等容积生理盐水，给药容积均为10 mL·kg -1。每天灌胃给药1次，连续给药30 d。实验结束前3 d，除对照外所有小鼠一次性腹腔注射200 mg·kg -1环磷酰胺。末次给药后30 min，每鼠尾静脉取血20 μL，加0.38 mL白细胞稀释液，混匀，用滴棒蘸取细胞悬液1滴，充入血球计数板的计数池中，室温静置2～3 min，待白细胞完全下沉，在低倍镜下计数四角4个大方格内的白细胞总数。另取尾静脉血2滴，推片，瑞氏染液染色，冲洗干净，自然干燥后，油镜下选择血涂片体尾交界处细胞分布均匀、着色良好的区域，按一定方向顺序对所见到的每一个白细胞进行分类，并用白细胞分类计数器记录100个白细胞中淋巴细胞和中性粒细胞的个数，根据白细胞总数计算每升血液中的淋巴细胞数和中性粒细胞数。
2.5 统计分析方法
统计分析用SPSS 16.0软件。各组原始数据符合方差齐性要求时，组间显著性检验用LSD检验。各组原始数据不符合方差齐性要求时，需对原始数据进行数据变换，变换后的数据符合方差齐性要求，用变换后的数据进行LSD检验。如变换后数据仍不符合方差齐性要求，组间显著性用秩和检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。
3.1 对T淋巴细胞增殖能力的影响
各组吸光度差值的原始数据符合方差齐性要求，将原始数据进行LSD检验。与对照组比较，0.25，0.50 g·kg -1的4种石斛均能显著增加吸光度差值(P＜0.05或P＜0.01)，表明这4种石斛均能提高T淋巴细胞增殖能力。结果见图1。
图1 4种石斛对小鼠T淋巴细胞增殖能力的影响(n=10,
±s)
经LSD检验；与对照组比较，
1)P＜0.05，
2)P＜0.01。
Fig.1 The effects of 4 species of Dendrobium on improving the ability of T lymphocyte proliferation in mice (n=10,
±s)
By LSD test; compared with control group,
1)P＜0.05,
2)P＜0.01.
3.2 对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响
各组小鼠巨噬细胞吞噬率的原始数据符合方差齐性要求，将原始数据进行LSD检验。与对照组比较，0.25，0.50 g·kg -1的铁皮石斛均能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬率(P＜0.05，P＜0.01)；鼓槌石斛和流苏石斛0.50 g·kg -1剂量能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬率(P＜0.05)，0.25 g·kg -1剂量对小鼠巨噬细胞吞噬率没有显著影响；金钗石斛0.25，0.50 g·kg -1剂量对小鼠巨噬细胞吞噬率均没有显著影响。结果见图2。
图2 4种石斛对增强小鼠巨噬细胞吞噬率的影响(n=10,
±s)
经LSD检验；与对照组比较，
1)P＜0.05，
2)P＜0.01。
Fig.2 The effects of 4 species of Dendrobium on increasing the phagocytic rate in mice(n=10,
±s)
By LSD test; compared with control group,
1)P＜0.05,
2)P＜0.01.
各组小鼠巨噬细胞吞噬指数的原始数据不符合方差齐性要求，原始数据用函数f(x)=1/x转换后符合方差齐性要求，将转换后的数据进行LSD检验。与对照组比较，0.25，0.50 g·kg -1的4种石斛均能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬指数(P＜0.05或P＜0.01)，结果见图3。
3.3 对提高免疫抑制小鼠血液中白细胞总数、淋巴细胞数和中性粒细胞数的影响
各组免疫抑制小鼠血液中白细胞数的原始数据符合方差齐性要求,将原始数据进行LSD检验。与对照组比较，模型组小鼠血液中的白细胞总数显著减少(P＜0.01)，说明模型成立。与模型组比较，4种石斛0.50 g·kg -1剂量均能显著升高血液中的白细胞数量(P＜0.05或P＜0.01)，0.25 g·kg -1剂量除金钗石斛外另外3种石斛也均能显著升高血液中的白细胞数(P＜0.05或P＜0.01)。结果见图4。
各组免疫抑制小鼠血液中淋巴细胞数的原始数据不符合方差齐性要求，原始数据经函数f(x)=ln(x)转换后符合方差齐性要求，将转换后的数据进行LSD检验。与对照组比较，模型组小鼠血液中的淋巴细胞数量显著减少(P＜0.01)；与模型组比较，0.25，0.50 g·kg -1剂量的4种石斛均能显著升高淋巴细胞数量(P＜0.01)。结果见图5。
图3 4种石斛对提高小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响(n=10,
±s)
用函数f(x)=1/x转换后的数据经LSD检验；与对照组比较，
1)P＜0.05，
2)P＜0.01。
Fig.3 The effects of 4 species of Dendrobium on raising the phagocytic index of the murine peritoneal macrophage (n=10,
±s)
By LSD test [after computed by f(x)=1/x]; compared with control group,
1)P＜0.05,
2)P＜0.01.
图4 4种石斛对免疫抑制小鼠血液中白细胞总数的影响(n=10,
±s)
经LSD检验；与对照组比较，
1)P＜0.01；与模型组比较，
2)P＜0.05，
3)P＜0.01。
Fig.4 The effects of 4 species of Dendrobium on the number of leukocyte in the blood of immunosuppressed mice (n=10,
±s)
By LSD test; compared with control group,
1)P＜0.01; compared with model group,
2)P＜0.05,
3)P＜0.01.
各组免疫抑制小鼠血液中中性粒细胞数的原始数据符合方差齐性要求，将原始数据进行LSD检验。与对照组比较，模型组小鼠血液中的中性粒细胞数量显著减少(P＜0.01)。与模型组比较，铁皮石斛0.25，0.50 g·kg -1剂量均能显著升高中性粒细胞数量(P＜0.05，P＜0.01)，而其他3种石斛对血液中中性粒细胞数量无显著影响。结果见图6。
图5 4种石斛对免疫抑制小鼠血液中淋巴细胞数的影响(n=10,
±s)
用f(x)=ln(x)转换后的数据经LSD检验；与对照组比较，
1)P＜0.01；与模型组比较，
2)P＜0.01。
Fig.5 The effects of 4 species of Dendrobium on the number of lymphocyte in the blood of immunesuppressed mice(n=10,
±s)
By LSD test [after computed by f(x)=ln(x)]; compared with control group,
1)P＜0.01; compared with model group,
2)P＜0.01.
图6 4种石斛对免疫抑制小鼠血液中中性粒细胞数的影响(n=10,
±s)
经LSD检验；与对照组比较，
1)P＜0.01；与模型组比较，
2)P＜0.05，
3)P＜0.01。
Fig.6 The effects of 4 species of Dendrobium on the number of neutrophils in the blood of immunosuppressed mice(n=10,
±s)
By LSD test; compared with control group,
1)P＜0.01; compared with model group,
2)P＜0.05,
3)P＜0.01.
石斛又名仙斛兰韵、不死草、还魂草。兰科石斛属中的多个种(如铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛等)均可作为药用石斛，其中以铁皮石斛最著名。中医将石斛用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软。《本草纲目》记载：石斛甘平无毒。主治伤中，除痹下气，补五脏虚劳赢瘦，强阴益精，久服厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，逐皮肤邪热痱气，脚膝疼冷痹弱。
本研究通过对T淋巴细胞增殖能力，巨噬细胞吞噬率和吞噬指数，免疫抑制小鼠血液中白细胞总数、淋巴细胞数和中性粒细胞数等免疫指标进行检测，考察中国药典2015年版中所载铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛4种石斛对增强免疫功能的影响。结果表明：4种石斛0.25，0.50 g·kg -1剂量均能显著增强T淋巴细胞增殖能力，并显著增加血液中的淋巴细胞数和巨噬细胞吞噬指数；此外，铁皮石斛0.25，0.50 g·kg -1剂量均能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬率、血液中的白细胞数、中性粒细胞数，鼓槌石斛和流苏石斛0.50 g·kg -1剂量能显著提高小鼠巨噬细胞吞噬率和血液中的白细胞数，金钗石斛0.50 g·kg -1剂量能显著升高血液中的白细胞数。结合图1～5可以看出4种石斛均能增强小鼠免疫功能，但铁皮石斛在增强巨噬细胞吞噬能力及提高免疫抑制小鼠血液中的中性粒细胞数方面效果优于金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛。
中性粒细胞具有变形运动和吞噬活动的能力，是机体对抗入侵病菌，特别是急性化脓性细菌的最重要的防卫系统。吞噬作用对于其要消灭的对象无特异性，在免疫学中称之为非特异性免疫。淋巴细胞也称免疫细胞，分为T淋巴细胞和B淋巴细胞两类，在机体特异性免疫过程中起主要作用。所谓特异性免疫，就是淋巴细胞针对某一种特异性抗原，产生与之相对应的抗体或进行局部性细胞反应，以杀灭特异性抗原。T淋巴细胞是淋巴细胞的主要组分，具有多种生物学功能，如直接杀伤靶细胞，辅助或抑制B细胞产生抗体，对特异性抗原和促有丝分裂原的应答反应以及产生细胞因子等。T细胞产生的免疫应答是细胞免疫，细胞免疫的效应形式主要有2种：与靶细胞特异性结合，破坏靶细胞膜，直接杀伤靶细胞；另一种是释放淋巴因子，最终使免疫效应扩大和增强。本研究结果显示，4种石斛均能增强小鼠免疫功能，但铁皮石斛的作用更全面，特别是在非特异性免疫方面优于金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛。
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Comparison of the Effects of Four Medicinal Species of Dendrobium on Improving Immunological Functions on Mice
YU Qi, MAO Peijiang, JIANG Jianmin, JIN Zuhan *(Zhejiang Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310023, China)
ABSTRACT：OBJECTIVE To compare the effects of Dendrobium officinale Kimura et Migo(DOK), Dendrobium nobile Lindl.(DNL), Dendrobium chrysotoxum Lindl.(DCL), and Dendrobium fimbriatum Hook.(DFH) on improving the immune functions on mice. METHODS The mice were orally administered with 0.25, 0.50 g·kg -1dosage of DOK, DNL, DCL and DFH respectively for 30 d. The T lymphocyte proliferation ability, the phagocytic index and the phagocyticrate of the murine peritoneal macrophage of mice were observed. The immunosuppressed mice induced by cyclophosphamide were orally administered with 0.25, 0.50 g·kg -1dosage of DOK, DNL, DCL and DFH respectively for 30 d. The number of leukocyte, lymphocytes and neutrophils in the immunosuppressed mice blood were counted under microscope. RESULTS The T lymphocyte proliferation ability were enhanced, the phagocytic index of the murine peritoneal macrophage and the number of lymphocytes were increased by 0.25, 0.50 g·kg -1dosage of DOK, DNL, DCL and DFH. The phagocytic rate, the number of leukocyte and neutrophils in the immune suppressed mice blood were increased by 0.25, 0.50 g·kg -1dosage of DOK. The phagocytic rate and the number of leukocyte were increased by 0.50 g·kg -1DCL and DFH. The number of leukocyte were increased by 0.50 g·kg -1dosage of DNL. CONCLUSION DOK, DNL, DCL and DFH all can enhance the immune functions in mice. DOK is more effective on raising the macrophage phagocytic ability and increasing the number of neutrophils in the immunosuppressed mice blood.
KEY WORDS：Dendrobium officinale Kimura et Migo; Dendrobium nobile Lindl.; Dendrobium chrysotoxum Lindl.; Dendrobium fimbriatum Hook.; immune function
中图分类号：R285.5
文献标志码：A
文章编号：1007-7693(2017)02-0191-05
DOI：10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.02.009
收稿日期：2016-09-09
基金项目：浙江省科技厅(2012F10002，2016F10035)
作者简介：余琪，男，教授级高工 Tel: (0571)85229698 E-mail: 13906508537@163.com *
通信作者：金祖汉，男，教授级高工 Tel: (0571)85241073 E-mail: j_zh502@sina.com