±s表示，并用SPSS 15.0统计分析软件进行处理，P值计算采用非配对双边t检验进行分析，P＜0.05认为有显著性差异。
王 倩，郑海雅，周 颖，钟益芳(丽水市人民医院，浙江 丽水 323000)
摘要：目的 探讨蛇床子素联合肿瘤坏死因子诱导凋亡配体[tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis inducing ligand，TRAIL]对乳腺癌干细胞的杀伤效应及机制。方法 用TRAIL及蛇床子素体外处理MCF-7乳腺癌非干细胞及MCF-7乳腺癌干细胞，MTT法检测乳腺癌细胞的细胞活力；流式细胞术检测乳腺癌细胞的凋亡；Western blot试验检测caspase-9和caspase-3的活化，凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating facter-1，Apaf-1)的表达水平，细胞色素C的释放；免疫共沉淀法检测Apaf-1和caspase-9前体的相互作用。结果 MCF-7肿瘤干细胞对TRAIL的敏感性显著低于MCF-7非干细胞。在MCF-7肿瘤干细胞的培养体系中加入蛇床子素能显著提高TRAIL对MCF-7肿瘤干细胞的细胞活力抑制率。Western blot实验结果表明，蛇床子素能显著上调MCF-7肿瘤干细胞中Apaf-1的表达水平，但不影响细胞色素C的释放。在MCF-7肿瘤干细胞中转染Apaf-1 siRNA后，蛇床子素联合TRAIL对MCF-7肿瘤干细胞的协同杀伤活性受到显著抑制。另外，免疫共沉淀实验结果表明，蛇床子素联合TRAIL能显著诱导MCF-7肿瘤干细胞中Apaf-1与caspase-9前体的相互作用，并使之发生活化。结论 蛇床子素通过上调Apaf-1的表达促进TRAIL对乳腺癌干细胞caspase-9的活化，从而增强TRAIL对乳腺癌干细胞的凋亡诱导效应。
关键词：蛇床子素；肿瘤坏死因子诱导凋亡配体；乳腺癌干细胞；Apaf-1；caspase-9；凋亡
有报道表明，乳腺癌是女性群体中发病率和致死率最高的恶性肿瘤，是严重危害女性健康的世界性难题 [1]。尽管对于乳腺癌的研究已经取得了一些进展，肿瘤的发生及转移的内在分子机制正逐步被揭示，关于乳腺癌对药物治疗的耐药性及分子机制目前仍不十分清楚 [2]。近期的研究表明，癌症可以被认为是一种干细胞失调性疾病，肿瘤可能是由一种具有“干细胞样”的恶性细胞增殖形成的，这种具有高度自我更新能力的肿瘤细胞被称为“肿瘤干细胞” [3-4]。肿瘤坏死因子诱导凋亡配体[tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis inducing ligand，TRAIL]是一种属于TNF超家族的细胞因子 [5]，它能选择性诱导肿瘤细胞发生凋亡，却不影响正常组织细胞的功能，因此TRAIL是一种有良好前景的新型低毒肿瘤治疗药物 [6-7]。然而，一些肿瘤细胞(特别是肿瘤干细胞)对TRAIL的治疗不敏感，并且分子机制也不十分清楚 [8]。因此，研究肿瘤干细胞如何产生对TRAIL抵抗的分子机制并采取辅助治疗手段提高肿瘤干细胞对TRAIL的敏感性有十分重要的意义。
1.1 细胞培养
人乳腺癌细胞系MCF-7购于美国ATCC。CD24-FITC和CD44-PE荧光抗体用于MCF-7肿瘤干细胞的分选，简要步骤如下：将MCF-7细胞系用CD24-FITC和CD44-PE荧光抗体在暗处冰上孵育40 min，之后用生理盐水将细胞洗涤3遍后，用流式细胞仪进行细胞分选，CD44阳性且CD24阴性的MCF-7细胞即为MCF-7乳腺癌干细胞，剩余细胞则为MCF-7非干细胞 [9]。MCF-7肿瘤干细胞及MCF-7非干细胞均培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃恒温培养箱中培养，通入5% CO 2。
1.2 试剂与仪器
噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT，货号：M2128)、蛇床子素(osthole，批号：O9265)、Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(批号：APOAF)均购于美国Sigma-Aldrich；TRAIL(美国R&D Systems)；CD24-FITC和CD44-PE荧光抗体均购于美国BD公司；DMEM培养基、胎牛血清购于美国Gibco；细胞蛋白提取液、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、caspase-9前体(pro-caspase-9)、凋亡酶激活因子(apoptotic protease activating facter-1，Apaf-1)、细胞色素C和β-actin抗人抗体均购于美国Cell Signaling；蛋白G免疫共沉淀琼脂糖珠(美国Santa Cruz)；Apaf-1 siRNA购于上海吉玛生物，序列正向：5’-UGCUCUACUACAUGAAGGA UU-3’，反向：5’-UCCUUCAUGUAGUAGAGCA UU-3’； Lipofectamine 2000(美国Invitrogen)；ECL试剂盒(美国Pierce，批号：32106)。
TECAN Sunrise Microplate Reader酶标仪(瑞士TECAN公司)；BD FACSAria II流式细胞分选仪(美国BD Biosciences公司)；Mini-PROTEAN Tetra电泳仪(美国Bio-Rad公司)。
2.1 Apaf-1基因沉默
为了抑制MCF-7肿瘤干细胞中Apaf-1的蛋白表达，作者设计了Apaf-1 siRNA。将MCF-7肿瘤干细胞接种在培养板上，孵育过夜后将Apaf-1 siRNA(终浓度为50 pmol·mL -1)用Lipofectamine 2000转染入肿瘤细胞中，培养24 h。
2.2 线粒体分离
为了检测MCF-7肿瘤干细胞中细胞色素C的释放，按文献所述方法使用0.015%地高辛蔗糖溶液分离MCF-7肿瘤干细胞中的细胞质，用Western blot方法检测从线粒体释放到细胞质中的细胞色素C [10]。
2.3 细胞活力检测
将MCF-7肿瘤干细胞或MCF-7非干细胞按每孔5×10 3接种在96孔板上，孵育过夜使细胞完全贴壁。将Apaf-1 siRNA(终浓度为50 pmol·mL -1)用0.5 μL的Lipofectamine 2000进行转染并用100 μL无血清培养基孵育6 h，之后将无血清培养基更换为100 μL有血清DMEM继续培养24 h。然后按实验设计将蛇床子素(终浓度为20 μmol·L -1)及TRAIL(终浓度为5 ng·mL -1)加入到培养体系中，培养48 h。之后加入20 μL MTT (5 mg·mL -1)培养4 h，移除孔内培养基，加入100 μL二甲亚砜，570 nm波长下测定OD值。相对细胞活力结果用实验组与对照组的OD值比值表示。TRAIL的半数有效浓度(IC 50)根据细胞活力曲线进行计算。实验分为对照组、蛇床子素组、TRAIL组、蛇床子素+TRAIL组、蛇床子素+TRAIL+Apaf-1 siRNA组，每组3个复孔。
2.4 细胞凋亡试验
将MCF-7肿瘤干细胞或MCF-7非干细胞按每孔5×10 5接种在6孔板上，孵育过夜使细胞完全贴壁。将TRAIL(终浓度为5 ng·mL -1)加入到培养体系中，培养48 h。之后将细胞用生理盐水洗涤2次，按照凋亡试剂盒说明书步骤将PI(碘化丙啶)和Annexin-V加入细胞中孵育20 min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡。实验分为对照组及TRAIL治疗组，每组采用3个复孔。
2.5 Western blot试验
将MCF-7肿瘤干细胞或MCF-7非干细胞按每孔5×10 5接种在6孔板上，孵育过夜使细胞完全贴壁。将Apaf-1 siRNA(终浓度为50 pmol·mL -1)用0.5 μL的Lipofectamine 2000进行转染并用100 μL无血清培养基孵育6 h，之后将无血清培养基更换为100 μL有血清DMEM继续培养24 h。然后按实验设计将蛇床子素(终浓度为20 μmol·mL -1)及TRAIL(终浓度为5 ng·mL -1)加入到培养体系中，培养48 h。之后将细胞用蛋白提取液进行裂解，裂解后的样品用12.5% SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、caspase-9前体、Apaf-1、细胞色素C和β-actin抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2 h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。目的蛋白的相对表达用目标蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示，蛋白灰度值分析用Image J软件处理。实验分为对照组、蛇床子素组、TRAIL组、蛇床子素+TRAIL组、蛇床子素+TRAIL+Apaf-1 siRNA组，每组采用3个复孔。
2.6 免疫共沉淀
将MCF-7肿瘤干细胞按每孔5×10 5接种在6孔板上，孵育过夜使细胞完全贴壁。将Apaf-1 siRNA(终浓度为50 pmol·mL -1)用0.5 μL的Lipofectamine 2000进行转染并用100 μL无血清培养基孵育6 h，之后将无血清培养基更换为100 μL有血清DMEM继续培养24 h。然后按照实验设计将蛇床子素(终浓度为20 μmol·mL -1)及TRAIL(终浓度为5 ng·mL -1)加入到培养体系中，培养48 h。之后裂解细胞并将细胞在12 000 r·min -1离心10 min，收取上清液分成等量2份，一份直接进行Western blot试验检测β-actin的表达作为对照，另外一份加入Apaf-1抗体孵育过夜。Apaf-1抗体孵育完毕后加入蛋白G琼脂糖珠孵育2 h。经过2 h免疫沉淀反应后进行Western blot试验，检测与Apaf-1结合的pro-caspase-9蛋白。结合pro-caspase-9蛋白的相对表达用目标蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示。实验分为对照组、蛇床子素组、TRAIL组、蛇床子素+TRAIL组、蛇床子素+TRAIL+Apaf-1 siRNA组，每组3个复孔。
2.7 统计学方法
实验重复3次，实验数据用
±s表示，并用SPSS 15.0统计分析软件进行处理，P值计算采用非配对双边t检验进行分析，P＜0.05认为有显著性差异。
3.1 MCF-7肿瘤干细胞对TRAIL的敏感性显著低于MCF-7非干细胞
MTT细胞活力试验显示，TRAIL(0～20 ng·mL -1)对MCF-7肿瘤干细胞的杀伤活性显著低于MCF-7非干细胞(P＜0.05)，同时TRAIL对MCF-7肿瘤干细胞的IC 50显著高于MCF-7非干细胞(P＜0.05)，表明乳腺癌干细胞对TRAIL有耐药性，结果见图1。
图1 TRAIL对MCF-7肿瘤干细胞和非干细胞的杀伤活性及IC
50影响的比较(n=3,
±s)
与MCF-7非干细胞相比，
1)P＜0.05。
Fig.1 Comparison of cytotoxic activity and IC
50of TRAIL on MCF-7 tumor stem cells and non-stem cells(n=3,
±s)
Compared with the MCF-7 non-stem cells,
1)P＜0.05.
流式细胞试验结果显示，在TRAIL处理下，MCF-7肿瘤干细胞的凋亡率显著低于MCF-7非干细胞(P＜0.05)，MCF-7肿瘤干细胞caspase-9和caspase-3的活化程度显著低于MCF-7非干细胞(P＜0.05)，结果见图2。以上结果表明，乳腺癌干细胞对TRAIL诱导的凋亡信号不敏感。
3.2 蛇床子素通过上调Apaf-1的表达提高MCF-7肿瘤干细胞对TRAIL的敏感性
MTT细胞活力试验结果显示，TRAIL (5 ng·mL -1)单独处理对MCF-7肿瘤干细胞的抑制作用较弱，然而联合蛇床子素后，TRAIL对MCF-7肿瘤干细胞的杀伤活性显著提高(P＜0.05)，表明蛇床子素辅助治疗能提高乳腺癌干细胞对TRAIL的敏感性，结果见图3。
图2 TRAIL对MCF-7肿瘤干细胞和非干细胞的细胞凋亡率、caspase-9和caspase-3活化程度影响的比较(n=3,
±s)
A-对细胞凋亡率的影响；B-对caspase-9和caspase-3活化程度的影响；与MCF-7非干细胞对照组相比，
1)P＜0.05；与MCF-7肿瘤干细胞对照组相比，
2)P＜0.05；与MCF-7非干细胞TRAIL组相比，
3)P＜0.05。
Fig.2 Comparison of apoptotic rate and activation of caspase-9 and caspase-3 of TRAIL on MCF-7 tumor stem cells and non-stem cells(n=3,
±s)
A-apoptotic rate; B-activation of caspase-9 and caspase-3; compared with the MCF-7 non-stem cells control group,
1)P＜0.05; compared with the MCF-7 cancer stem cells control group,
2)P＜0.05; compared with the TRAIL-treated MCF-7 non-stem cells group,
3)P＜0.05.
Western blot试验结果显示，MCF-7肿瘤干细胞中的Apaf-1蛋白表达水平明显低于MCF-7非干细胞(P＜0.05)，提示乳腺癌干细胞可能通过Apaf-1途径抵抗TRAIL的抗肿瘤活性，结果见图4。
蛇床子素能显著上调MCF-7肿瘤干细胞中Apaf-1的表达水平(P＜0.05)，提示蛇床子素在MCF-7肿瘤干细胞中对TRAIL的增效作用可能和Apaf-1的上调有关，结果见图5。
进一步实验结果显示，在MCF-7肿瘤干细胞中转染Apaf-1 siRNA沉默Apaf-1的表达后，蛇床子素联合TRAIL对MCF-7肿瘤干细胞的杀伤活性受到显著抑制(P＜0.05)，证实了蛇床子素通过上调Apaf-1的表达提高MCF-7肿瘤干细胞对TRAIL的敏感性，结果见图6。
3.3 蛇床子素通过上调Apaf-1的表达促进caspase-9的活化
研究表明，只有在细胞色素C的存在下，caspase-9前体才能通过与Apaf-1的结合而发生活化 [11]。实验结果显示，TRAIL能显著诱导细胞色素C从线粒体中释放到细胞质中(P＜0.05)，而与蛇床子素无关(图7A)。另外，蛇床子素单独处理虽能上调MCF-7肿瘤干细胞中Apaf-1的表达却不能直接诱导Apaf-1与caspase-9的相互作用，而蛇床子素联合TRAIL不仅能上调MCF-7肿瘤干细胞中Apaf-1的表达，同时也能诱导Apaf-1与caspase-9的相互作用(图7B)。以上结果表明，TRAIL通过诱导细胞色素C的释放介导细胞的凋亡，而蛇床子素通过上调Apaf-1的表达促进TRAIL诱导的Apaf-1和caspase-9前体的相互作用。
Western blot实验结果显示蛇床子素联合TRAIL能显著活化caspase-9及其下游效应分子caspase-3。沉默Apaf-1的表达后，蛇床子素则不能促进TRAIL对caspase-9的活化(图7C)，表明蛇床子素通过上调Apaf-1的表达促进TRAIL对caspase-9及其下游效应分子caspase-3的活化。
图3 蛇床子素联合TRAIL对MCF-7肿瘤干细胞杀伤活性的影响(n=3,
±s)
与对照组相比，
1)P＜0.05；与TRAIL组相比，
2)P＜0.05。
Fig.3 Effect of osthole combined with TRAIL on cytotoxicity of MCF-7 tumor stem cells(n=3,
±s)
Compared with the control group,
1)P＜0.05; compared with the TRAIL group,
2)P＜0.05.
图4 MCF-7肿瘤干细胞和非干细胞的Apaf-1表达水平的比较(n=3,
±s)
与MCF-7非干细胞相比，
1)P＜0.05。
Fig.4 Comparison of expression of Apaf-1 on MCF-7 tumor stem cells and non-stem cells(n=3,
±s)
Compared with the MCF-7 non-stem cells,
1)P＜0.05.
图5 蛇床子素联合TRAIL对MCF-7肿瘤干细胞Apaf-1表达水平的影响(n=3,
±s)
与对照组相比，
1)P＜0.05；与TRAIL组相比，
2)P＜0.05。
Fig.5 Effect of osthole combined with TRAIL on expression of MCF-7 tumor stem cells(n=3,
±s)
Compared with the control group,
1)P＜0.05; compared with the TRAIL group,
2)P＜0.05.
图6 Apaf-1 siRNA对蛇床子素联合TRAIL杀伤MCF-7肿瘤干细胞的抑制作用(n=3,
±s)
与对照组相比，
1)P＜0.05；与蛇床子素+TRAIL组相比，
2)P＜0.05。
Fig.6 Inhibitory effect of the cytotoxicity of the co-treatment with TRAIL and osthole in the MCF-7 cancer stem cells(n=3,
±s)
Compared with the control group,
1)P＜0.05; compared with the osthole +TRAIL group,
2)P＜0.05.
图7 蛇床子素通过上调Apaf-1的表达促进caspase-9的活化
A-TRAIL诱导MCF-7肿瘤干细胞中细胞色素C的释放；B-蛇床子素通过上调Apaf-1的表达促进TRAIL诱导的Apaf-1和pro-caspase-9的相互作用；C-蛇床子素联合TRAIL显著活化MCF-7肿瘤干细胞中的caspase-9及其下游效应分子caspase-3；与对照组相比，
1)P＜0.05；与蛇床子素+ TRAIL组相比，
2)P＜0.05。
Fig.7 Osthole promoted the activation of caspase-9 through upregulating the expression of Apaf-1
A-TRAIL induced the release of cytochrome C in the MCF-7 cancer stem cells; B-Osthole promoted the TRAIL-induced interaction with Apaf-1 and pro-caspase-9 through upregulating the expression of Apaf-1 in the MCF-7 cancer stem cells; C-Co-treatment with osthole and TRAIL significantly triggered the caspase-9 and the downstream of caspase-3 in the MCF-7 cancer stem cells; Compared with the control group,
1)P＜0.05; compared with the osthole+TRAIL group,
2)P＜0.05.
有文献指出，乳腺癌组织中肿瘤干细胞的存在是造成药物抵抗的重要因素 [12]，因此提高乳腺癌干细胞对TRAIL治疗的敏感性可能是克服TRAIL抵抗的有效策略 [13]。在本研究中，实验结果表明乳腺癌干细胞对TRAIL的敏感性显著低于非干细胞，TRAIL单独处理对乳腺癌干细胞的凋亡诱导能力较弱，这些实验结果与文献报道一致。
蛇床子素是从中药蛇床子中提取的活性物质，在现代中医治疗中有广泛的用途 [14]。近些年来的研究发现，蛇床子素还具有一定的抗肿瘤作用 [15]，然而蛇床子素对乳腺癌干细胞的辅助治疗作用至今还很少报道。在本研究中，实验结果表明蛇床子素单独处理虽不能显著杀伤乳腺癌干细胞，但却能显著提高TRAIL对乳腺癌干细胞的杀伤能力，两者联合存在治疗乳腺癌干细胞的药物协同效应。
研究表明，TRAIL能诱导肿瘤细胞发生凋亡，它主要通过激活caspase-8/tBid信号通路损伤肿瘤细胞的线粒体膜电位，使细胞色素C等凋亡诱导因子释放到细胞质中，从而激活细胞的凋亡通路 [16-17]。在细胞色素C依赖的凋亡信号通路中，下游分子caspase-9的活化至关重要，活化的caspase-9能直接激活caspase-3这一效应分子，进而使肿瘤细胞的DNA发生片段化，从而发生凋亡 [18-19]。研究表明在细胞色素C活化caspase-9的过程中，Apaf-1蛋白的参与至关重要。Apaf-1是1个分子量为130 kDa的凋亡相关蛋白，有多个caspase结合位点。细胞质中的Apaf-1在细胞色素C的活化下能与caspase-9前体结合，从而激活caspase-9并诱导细胞发生caspases依赖的凋亡 [20-21]。在本研究中，实验结果表明蛇床子素增强TRAIL对乳腺癌干细胞杀伤活性的机制和其能上调Apaf-1的表达有关。TRAIL能引起乳腺癌干细胞细胞色素C的释放，而蛇床子素可能通过上调Apaf-1的表达增加其与caspase-9的结合，从而增强caspase-9的活化和凋亡，因此TRAIL和蛇床子素存在协同抗肿瘤作用。
综上所述，本研究证明了蛇床子素能显著提高乳腺癌干细胞对TRAIL的敏感性。通过机制研究发现，蛇床子素能通过上调Apaf-1的表达使乳腺癌干细胞中的caspase-9在细胞色素C的作用下与Apaf-1结合而发生活化，进而使乳腺癌干细胞进入凋亡程序。这些研究为逆转TRAIL对乳腺癌的耐药性提供了新的思路和理论依据。
REFERENCES
[1] SIEGEL R, NAISHADHAM D, JEMAL A. Cancer statistics, 2013 [J]. CA Cancer J Clin, 2013, 63(1): 11-30.
[2] ZANARDI E, BREGNI G, DI COSIMO S, et al. Better together: Targeted combination therapies in breast cancer [J]. Semin Oncol, 2015, 42(6): 887-895.
[3] DE SOUSA E, MELO F, VERMEULEN L. Wnt signaling in cancer stem cell biology [J]. Cancers (Basel), 2016, 8(7): 60.
[4] HONG M, TAN H Y, FENG Y, et al. Cancer stem cells: the potential targets of chinese medicines and their active compounds [J]. Int J Mol Sci, 2016, 17(6): 893.
[5] OSHI P, JEON Y J, CROCE C M, et al. MicroRNA-148a reduces tumorigenesis and increases TRAIL-induced apoptosis in NSCLC [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015, 112(28): 8650-8655.
[6] HARI Y, HARASHIMA N, HARADA M, et al. Bcl-xL inhibition by molecular-targeting drugs sensitizes human pancreatic cancer cells to TRAIL [J]. Oncotarget, 2015, 6(39): 41902-41915.
[7] AMARANTE-MENDES G P, GRIFFITH T S. Therapeutic applications of TRAIL receptor agonists in cancer and beyond [J]. Pharmacol Ther, 2015(155): 117-131.
[8] RECIO-BOILES A, ILMER M, ALT E, et al. JNK pathway inhibition selectively primes pancreatic cancer stem cells to TRAIL-induced apoptosis without affecting the physiology of normal tissue resident stem cells [J]. Oncotarget, 2016, 7(9): 9890-9906.
[9] NANDY S B, ARUMUGAM A, LAKSHMANASWAMY R, et al. MicroRNA-125a influences breast cancer stem cells by targeting leukemia inhibitory factor receptor which regulates the Hippo signaling pathway [J]. Oncotarget, 2015, 6(19): 17366-17378.
[10] XU Y, CUI J H, DU Z J, et al. Antisensenucleic acids of miR-24 promoted the doxorubicin-induced apoptosis via BIM-Smac/DIABLO pathway in colon cancer [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2016, 33(2): 175-181.
[11] MCSTAY G P, GREEN D R. Preparation of cytosolic extracts and activation of caspases by cytochrome C [J]. Cold Spring Harb Protoc, 2014, 2014(7): 778-782.
[12] YANG Z X, SUN Y H, JIANG G Q, et al. Increased activity of CHK enhances the radioresistance of MCF-7 breast cancer stem cells [J]. Oncol Lett, 2015, 10(6): 3443-3449.
[13] PIGGOTT L, OMIDVAR N, CLARKSON R W, et al. Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent TRAIL [J]. Breast Cancer Res, 2011, 13(5): R88.
[14] BALAYSSAC S, GILARD V, MALET-MARTINO M, et al. Analysis of herbal dietary supplements for sexual performance enhancement: first characterization of propoxyphenylthiohydroxyhomosildenafil and identification of sildenafil, thiosildenafil, phentolamine and tetrahydropalmatine as adulterants [J]. J Pharm Biomed Anal, 2012, 63(7): 135-150.
[15] LIN K, GAO Z, FU Q, et al. Osthole suppresses the proliferation and accelerates the apoptosis of human glioma cells via the upregulation of microRNA-16 and downregulation of MMP-9 [J]. Mol Med Rep, 2015, 12(3): 4592-4597.
[16] HAN M A, WOO S M, KWON T K, et al. 6-Shogaol enhances renal carcinoma Caki cells to TRAIL-induced apoptosis through reactive oxygen species-mediated cytochrome c release and down-regulation of c-FLIP(L) expression [J]. Chem Biol Interact, 2015(228): 69-78.
[17] LI G, FU D, CHENG B, et al. CYC1 silencing sensitizes osteosarcoma cells to TRAIL-induced apoptosis [J]. Cell Physiol Biochem, 2014, 34(6): 2070-2080.
[18] WEN Q, ZHANG X, YANG P H, et al. A novel strategy for real-time and in situ detection of cytochrome C and caspase-9 in Hela cells during apoptosis [J]. Analyst, 2014, 139(10): 2499-2506.
[19] LIU J, QIN CK, QIN C Y, et al. OSU-03012, a non-Cox inhibiting celecoxib derivative, induces apoptosis of human esophageal carcinoma cells through a p53/Bax/cytochrome c/caspase-9-dependent pathway [J]. Anticancer Drugs, 2013, 24(7): 690-698.
[20] HU Q, WU D, SHI Y, et al. Molecular determinants of caspase-9 activation by the Apaf-1 apoptosome [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(46): 16254-16261.
[21] SHANG J, YANG F, SUN S, et al. MicroRNA-23a antisense enhances 5-fluorouracil chemosensitivity through APAF-1/ caspase-9 apoptotic pathway in colorectal cancer cells [J]. J Cell Biochem, 2014, 115(4): 772-784.
Anti-tumor Effect of Osthol Combined with Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis Inducing Ligand on Breast Cancer Stem Cells
WANG Qian, ZHENG Haiya, ZHOU Ying, ZHONG Yifang(People’s Hospital of Lishui City, Lishui 323000, China)
ABSTRACT：OBJECTIVE To investigate the synergistic effect and mechanism of osthole and tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) in breast cancer stem cells. METHODS After treatment of osthole and TRAIL in the MCF-7 cancer stem cells (MCF-7-CSCs) as well as the MCF-7-non-cancer stem cells (MCF-7-non-CSCs), MTT assay was performed to detect the cell viability; flow cytometry analysis was performed to measure the cell apoptosis; Western blot analysis was performed to evaluate the activation of caspase-9 and caspase-3, expression of Apaf-1, and release of cytochrome C; co-immunoprecipitation was performed to detect the interaction with Apaf-1 and pro-caspase-9, respectively. RESULTS The sensitivity of MCF-7-CSCs to TRAIL was significantly lower than the MCF-7-non-CSCs. Addition of osthole significantly increased the inhibitory rate of MCF-7-CSCs treated with TRAIL. The results of Western blot indicated that the treatment of osthole could significantly upregulate the expression of Apaf-1 without changing the release of cytochrome C. Transfection with Apaf-1 siRNA abolished the synergistic effect of osthole and TRAIL in MCF-7-CSCs. In addition, the results of co-immunoprecipitation indicated that the combination of osthole and TRAIL significantly induced the interaction with Apaf-1 and pro-caspase-9, which led to the activation of caspase-9 in MCF-7-CSCs. CONCLUSION Osthole promotes the TRAIL-induced activation of caspase-9 and apoptosis by upregulating the expression of Apaf-1 in the breast cancer stem cells.
KEY WORDS：osthole; tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis inducing ligand (TRAIL); breast cancer stem cells; Apaf-1; caspase-9; apoptosis
中图分类号：R285.5
文献标志码：A
文章编号：1007-7693(2017)02-0225-07
DOI：10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.02.016
收稿日期：2016-07-21
作者简介：王倩，女，硕士，主管技师 Tel: 18957092550 E-mail: lishuiwangqian@163.com