HPLC同时测定紫斑牡丹花粉中槲皮素、木犀草素、异鼠李素的含量

王斌利 1，王新娣 2，石晓峰 1,2*，张莉霞 1(1.甘肃中医药大学，兰州 730030；2.甘肃省医学科学研究院，兰州 730050)

摘要：目的建立同时测定紫斑牡丹花粉中3个黄酮类化合物槲皮素、木犀草素、异鼠李素含量的RP-HPLC。方法样品用25倍75%乙醇回流提取2 h，提取液加15%盐酸水解2.5 h；采用Agilent Eclipse plus C 18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以甲醇-乙腈-0.1%磷酸(25∶13∶62)为流动相等度洗脱，流速：1.0 mL·min -1，检测波长：360 nm，柱温35 ℃。结果槲皮素、木犀草素和异鼠李素分别在1.3～26.0，0.7～14.0，8.4～168.0 μg·mL -1内呈良好的线性关系，相关系数均≥0.999 9；加样回收率(n=9)的RSD值分别为99.8%，100.3%，100.8%。结论该方法简单、高效，可作为紫斑牡丹花粉质量控制的参考。

关键词：紫斑牡丹花粉；槲皮素；木犀草素；异鼠李素；含量测定；高效液相色谱法

紫斑牡丹Paeonia rockii为毛茛科Ranunculaceae芍药属Paeonia多年生木本植物，又名甘肃牡丹、西北牡丹，因其花瓣基部有一个明显的色斑而得名 [1]，是仅次于中原牡丹品种群的第2大品种群 [2]，是我国中西部地区的特有中药材和花中珍品，分布于四川北部、甘肃南部、陕西秦岭中段以西，被列为国家珍稀濒危三级重点保护植物 [3]。近10年来，紫斑牡丹在我省陇南、天水、定西、临夏、兰州等地广泛种植，不仅是一种重要的观赏植物，其根皮作为药用丹皮被甘肃省中药材标准收载，具有清热凉血，活血化瘀的功效 [4-5]。我国自公布了油菜花粉、松花粉、向日葵花粉、紫云英花粉、养麦花粉、高粱花粉等可作为药食兼用花粉之后，花粉作为普通食品得到应有的重视 [6-7]。有关紫斑牡丹花粉的研究目前尚未见文献报道，为了对其进行开发利用，本实验采用HPLC法同时测定了紫斑牡丹花粉中槲皮素、木犀草素和异鼠李素的含量，结果表明该方法简单、快速、高效，可为紫斑牡丹花粉的进一步开发提供技术支撑。

1 仪器与材料

Agilent 1100 型高效液相色谱仪，四元泵，可变波长扫描紫外检测器，Agilent 1100化学工作站，标准手动进样器(美国安捷伦公司生产)，AE260型万分之一电子天平(瑞士Mettle Toledo公司)，CP225D型十万分之一电子分析天平(德国Sartorius公司生产)。

槲皮素对照品(批号：100081-200907，含量：96.5%，供含量测定用)、异鼠李素对照品(批号：110860-200608，供含量测定用)均由中国食品药品检定研究院提供；木犀草素对照品(贵州迪大生物有限公司，批号：491-70-3，含量≥98%)；甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。紫斑牡丹花粉于2015年5月采自兰州新区中川牡丹园，其原植物经兰州牡丹园艺开发公司赵潜龙高级工程师鉴定为Paeonia rockii (S. G. Haw et L. A. Lauener) T. Hong et J. J. Li。

2 方法与结果

2.1.1 对照品溶液精密称取槲皮素6.50 mg、木犀草素3.50 mg、异鼠李素10.39 mg，分别置于5，5，50 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，分别配制成浓度为1.30，0.70，0.21 mg·mL -1的槲皮素、木犀草素、异鼠李素单一对照品储备液。分别精密吸取槲皮素、木犀草素储备液各0.1 mL，异鼠李素储备液4 mL，置5 mL量瓶中，用甲醇定容，配制成槲皮素、木犀草素、异鼠李素分别为26.0，14.0，168.0 μg·mL -1的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液精密称取紫斑牡丹花粉2 g，置100 mL圆底烧瓶中，加入75%乙醇50 mL，称重；回流提取2 h，冷却后再称重，用75%乙醇补足减失质量，过滤；吸取滤液40 mL于圆底烧瓶中，加入15% HCl溶液10 mL，于水浴锅上回流2.5 h，放冷，转移至50 mL量瓶中，加75%乙醇定容，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

Agilent Eclipse plus C 18色谱柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸(25∶13∶62)；流速：1.0 mL·min -1；检测波长：360 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

2.3 系统适用性试验分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各20 μL，按“2.2”项下色谱条件进样分析，并记录色谱图，结果样品中槲皮素、木犀草素和异鼠李素色谱峰的保留时间分别为16.6，18.0，35.6 min。目标峰与其相邻色谱峰的分离度＞1.5，理论板数以槲皮素计≥6 000，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图
A-对照品；B-样品；1-槲皮素；2-木犀草素；3-异鼠李素。
Fig.1 HPLC chromatograms
A-reference substance; B-sample; 1-quercetin; 2-luteolin 3-isorhamnetin.

精密吸取混合对照品溶液20 μL，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次。测得槲皮素、木犀草素和异鼠李素峰面积的RSD值分别为0.38%，1.10%，0.63%；保留时间的RSD值分别为1.10%，0.94%，1.01%。结果表明，该仪器精密度良好。

精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置于1 mL量瓶中，用甲醇定容，摇匀，配制成系列浓度的混合对照品溶液，依上述色谱条件，分别进样20 μL进行测定，以槲皮素、木犀草素和异鼠李素的峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X，μg·mL -1)为横坐标，绘制标准曲线。得到槲皮素、木犀草素和异鼠李素的线性回归方程分别为Y=58.65X-7.878 2(r= 0.999 9)、Y=59.73X+0.264 5(r=0.999 9)、Y=66.46X-56.034 6(r=0.999 9)。结果表明三者浓度分别在1.3～26.0，0.7～14.0和8.4～168.0 μg·mL -1内呈良好线性关系。

精密吸取同一供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别于0，2，4，6，8，12，24 h进样20 μL，测定峰面积。结果槲皮素、木犀草素和异鼠李素峰面积的RSD值分别为0.76%，2.92%，1.12%。表明紫斑牡丹花粉样品溶液在24 h内稳定。

精密称取同批紫斑牡丹花粉6份，各2 g。按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行含量测定。结果槲皮素、木犀草素和异鼠李素的平均含量分别为0.166，0.055，3.275 mg·g -1，RSD分别为2.11%，2.73%，2.29%，表明本方法重复性良好。

取“2.6”项下已测知含量的紫斑牡丹花粉1 g，共9份，精密称定，分别置100 mL圆底烧瓶中，分别精密加入槲皮素、木犀草素、异鼠李素对照品适量，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定各待测成分的量，计算回收率，结果见表1。槲皮素、木犀草素和异鼠李素的平均回收率(n=9)分别为99.8%，100.3%，100.8%，RSD分别为2.78%，2.66%，2.36%。

表1 紫斑牡丹花粉中3种黄酮回收试验结果(n=9)
Tab.1 Recoveries of the three flavonoids in pollen of paeonia rockii(n=9)

取对照品溶液用甲醇逐步稀释、进样。当信噪比为10时，槲皮素、木犀草素、异鼠李素的定量限分别为2.48，1.93，7.02 μg·mL -1。

取定量限浓度的对照品溶液再用甲醇逐步稀释、进样。当信噪比为3时，槲皮素、木犀草素、异鼠李素的检测限分别为1.56，0.55，1.93 μg·mL -1。

2.1 0.1 不同柱温精密吸取供试品溶液和对照品溶液，分别将柱温设定为25，30，35 ℃(其他条件不变)进行含量测定。测得槲皮素、木犀草素、异鼠李素的平均含量分别为0.165，0.054，3.206 mg·g -1，RSD值分别为0.35%，2.15%，0.87%。表明在其他条件不变的前提下，柱温的微小变化对样品的含量测定和色谱峰分离均无明显的影响。

2.1 0.2 不同流速精密吸取供试品溶液和对照品溶液，分别将流速设定为0.9，1.0，1.1 mL·min -1(其他条件不变)进行含量测定。测得槲皮素、木犀草素、异鼠李素的平均含量分别为0.166，0.055，3.256 mg·g -1，RSD值分别为0.92%，2.79%，1.34%。表明在其他条件不变的前提下，流速的微小变化对样品的含量测定和色谱峰分离均无明显的影响。

精密称取3批紫斑牡丹花粉2 g，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液各3份，进样测定，以外标法计算含量。结果见表2。

表2 样品的含量测定结果(n=3)
Tab.2 Results of the content determination of sample(n=3)

3 讨论

根据文献报道 [8-11]，可知黄酮类化合物的检测波长为255，360，370 nm。本实验分别对槲皮素、木犀草素和异鼠李素对照品溶液在200～500 nm进行全波长扫描，结果显示槲皮素在260，370 nm、木犀草素在210，360 nm、异鼠李素在360 nm波长处有最大吸收；考虑到紫斑牡丹花粉中所含的成分复杂，兼顾3个目标成分的最大吸收波长的同时，为达到提高被测成分高效液相色谱色谱峰响应值和分离度的要求，本研究采用360 nm作为检测波长。

本实验分别考察了不同比例的甲醇-磷酸水和乙腈-磷酸水流动相系统，各成分与杂质均没有得到良好的分离，遂考虑甲醇-乙腈-磷酸水流动相系统，发现其分离效果较好，进而优选确定甲醇-乙腈-0.1%磷酸(25∶13∶62)作为流动相。按照优化后的色谱条件，3种黄酮类成分色谱峰的分离度较好，可满足同时测定的要求。

本实验以3种黄酮含量为指标通过单因素试验分别逐一筛选了提取溶剂、提取时间、盐酸浓度及水解时间，最后确定以75%的乙醇回流提取2 h，再加15%的盐酸水解2.5 h的方法来制备供试品溶液。

花粉是有花植物雄蕊中的雄性生殖细胞，其中包含着孕育新生命所必需的全部营养物质 [12]；而不同的植物花粉中所含营养成分及其含量均有所差异，目前业已有8种花粉作为新食品资源得到开发 [6-7]。文献报道 [13]，牡丹花粉中含有大量可以促进健康、增加肌体防御能力的天然活性物质,包括80多种酶、黄酮类化合物、激素、核酸和有机酸等，因此，对紫斑牡丹花粉进行深入研究和开发利用具有很大的前景。

通过以上试验表明，本研究采用HPLC测定紫斑牡丹花粉中3种黄酮类成分的含量，方法简便，结果准确，重复性较好，主成分与各个杂质分离度较好，且专属性较好；紫斑牡丹花粉中黄酮类成分主要为槲皮素、木犀草素和异鼠李素及其苷，其苷元的含量依次为异鼠李素＞槲皮素＞木犀草素；该结果为紫斑牡丹花粉进一步开发利用提供了科学依据。

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Simultaneous Determination of Quercetin, Luteolin and Isorhamnetin in Pollen of Paeonia Rockii by RP-HPLC

WANG Binli 1, WANG Xindi 2, SHI Xiaofeng 1,2*, ZHANG Lixia 1(1.Gansu University of TCM, Lanzhou 730030, China; 2.Gansu Academy of Medical Science, Lanzhou 730050, China)

ABSTRACT：OBJECTIVE To develope a RP-HPLC method for simultaneous determination of three flavonoids (quercetin, luteolin, isorhamnetin) in pollen from Paeonia rockii. METHODS The samples were pretreated, including reflux extraction with 75% ethanol for 2 h(with the ratio of liquor to material of 25∶1), and then the extracting solution was hydrolyzed with 15% hydrochloric acid for another 2.5 h. Agilent Eclipse plus C 18column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) was adopted. The mobile phase was methanol-acetonitrile-0.1% phosphoric acid (25∶13∶62) at the flow rate of 1.0 mL·min -1. The detection wavelength was 360 nm and the column temperature was 35 ℃. RESULTS Calibration curves were found to be linear in the range of 1.3-26.0 μg·mL -1for luteolin, 0.7-14.0 μg·mL -1for quercetin and 8.4-168.0 μg·mL -1for isorhamnetin. The correlation coefficients were greater or equal to 0.999 9. The average recoveries(n=9) of three flavonoids were 99.8%, 100.3% and 100.8%, respectively. CONCLUSION The developeded method is simple and efficient, which can be used for quality control of pollen of Paeonia rockii.

KEY WORDS：pollen of paeonia rockii; quercetin; luteolin; isorhamnetin; content assay; HPLC

作者简介：王斌利，女，硕士生 Tel: (0931)2302684 E-mail: 1028928175@qq.com *

通信作者：石晓峰，男，主任药师 Tel: (0931)2302664 E-mail: shixiaofeng2005@sina.com