百贝益肺胶囊含量测定的方法改进

(1.昭通市食品药品检验所，云南昭通 657000；2.永孜堂制药有限公司，云南昭通 657000)

摘要：目的增加评价指标，建立科学、合理的百贝益肺胶囊含量测定方法。方法 C18小柱纯化样品，优化色谱条件为：Vp-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：20 ℃；变动流速；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱；进样量：10 μL；检测波长：203 nm。结果所测成分三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1分别在40.24～241.44(r=0.999 6)，91.50～549.00(r=0.999 9)，35.72～241.32(r=0.999 8)μg·mL-1内线性关系良好；加样回收率为 94.15%～99.81%，RSD 为 1.12%～1.94%。结论该方法准确，重复性良好，可为修订标准提供依据。

百贝益肺胶囊始收载于《卫生部颁药品标准》中药成方制剂第 1册，由白及、浙贝母、桔梗、百部、百合、海浮石、紫菀、三七、功劳木、甘草组成，2012年升级成国家标准，增加贵细药材三七的含量测定，以人参皂苷Rg1为评价指标[1]。三七为药典收录品种，中国药典2015年版以3个成分控制其质量[2]11-12；原标准[1]以单一成分，也非标志性成分作为评价指标，存在一定的不科学性，且需要特定Inertsll ODS-SP型色谱柱。因此，本实验增加三七皂苷R1和人参皂苷Rb1为含量测定指标，选择通用ODS短柱，进行方法改进，使其测定方法更加科学合理。

1 仪器、试药及材料

LC-2010AHT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；MS105DU 电子天平(梅特勒-托利多上海公司)；WF-120EH超声仪(宁波海曙五方)；WondaSep C18小柱(日本岛津，500 mg/6 mL)。

三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1对照品均来源于中国药品生物制品检定所，批号分别为：110745-200312、110703-201128、110704-201223，含量分别为未标示(以100%计)、93.4%和95.9%；乙腈为色谱纯，甲醇为分析纯，水为纯化水。百贝益肺胶囊(昭通永孜堂制药有限公司，批号：20160520，20161129，20170222，规格：每粒0.4 g)；缺三七阴性对照样品(永孜堂制药有限公司，批号：20170222)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Vp-ODS 色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温：20 ℃；流速：0～25 min，1 mL·mim-1，25～30 min ， 1 → 0.7 mL·mim-1， 30～80 min ，0.7 mL·mim-1；流动相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱：0～25 min，19%A，25～30 min，19%→28%A，30～65 min，28%→29%A；65～75 min，29%→40%A；75～80 min，40%→19%A)；进样量：10 μL。检测波长：203 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1对照品适量，加甲醇分别制成0.80，1.83，0.71 mg·mL-1的储备溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备精密称取本品内容物2.5 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理(功率 250 W，频率 40 kHz)30 min，放冷，称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液10 mL，蒸干，残渣加水2 mL，使溶解，使通过已活化的C18小柱，依次用水5 mL、20%乙醇10 mL洗脱，弃去洗脱液，再用50%乙醇20 mL洗脱，收集洗脱液，浓缩至近干，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜过滤，即得。

2.2.3 阴性溶液的制备精密称取缺三七阴性对照样品2.5 g，按“2.2.2”项下方法制成阴性对照溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性试验分别精密吸取对照品溶液、样品溶液、阴性对照溶液各10 μL，注入液相色谱仪测定。结果供试品溶液色谱中，在与三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1对照品相同保留时间处有吸收峰，而阴性样品溶液在相同保留时间处未显吸收峰，表明阴性样品对测定无干扰，结果见图 1。

图1 百贝益肺胶囊HPLC色谱图
A-对照品；B-样品；C-阴性样品；1-三七皂苷R1；2-人参皂苷Rg1；3-人参皂苷Rb1。
Fig. 1 HPLC chromatogram of Baibei Yifei capsule
A-control sample; B-sample; C-negative sample; 1-notoginsenoside R1; 2-ginsenoside Rg1; 3-ginsenoside Rb1.

2.3.2 线性关系分别取“2.2.1”项下对照品储备液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，进样测定。以峰面积为纵坐标(Y)，浓度为横坐标(X)，绘制3个对照品的标准曲线。结果三七皂苷 R1回归方程为Y=2 655.91X+203.93(r=0.999 6)、人参皂苷Rg1为Y=2 128.79X+6 143.73(r=0.999 9)、人参皂苷Rb1为Y=2 669.56X+1 2947.70(r=0.999 8)，线性范围分别为 40.24～241.44， 91.50～549.00， 35.72～214.32 μg·mL-1。

2.3.3 仪器精密度取同一混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测得三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1的峰面积RSD(n=6)分别为0.6%，0.3%，0.8%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性取“2.2.2”项下供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分隔0，2，4，8，24，48 h分别进样，测得混合对照品及供试品中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的峰面积RSD(n=6)分别为1.5%，1.0%，1.3%，表明冷藏密封放置48 h，该溶液稳定。

2.3.5 重复性精密称取同一批号(20160520)样品，按“2.2.2”项下方法平行制备 6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录测定峰面积并计算。结果每粒含三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1和人参皂苷Rb1含量的RSD分别为1.9%，1.6%和2.1%(n=6)。

2.3.6 加样回收率精密称取已知含量的样品1.25 g，加入“2.2.1”项下对照品储备液适量，挥去甲醇，按“2.2.2”项下方法制备成供试品溶液，测得3个成分的峰面积，计算回收率，结果见表1。

2.3.7 样品测定取样品 3批，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱进样测定，记录峰面积，并计算样品含量，结果见表2。

3 讨论

三七主成分的测定、提取方法相对成熟，基本上类似。水饱和正丁醇反复萃取、大孔树脂分离纯化最为常用[3-6]；固相萃取也有运用[7]，还有复方丹参片中直接用70%甲醇提取[1]1214-1215。在本实验中，除了比较上述的提取方法，还考察了以下方法：①分别用 10%乙醇、乙醚超声，弃提取液，残渣用甲醇或水饱和正丁醇超声提取；②过氧化铝柱、氧化铝与大孔树脂混合柱，用不同浓度乙醇洗脱；③通过薄层色谱法纯化。从实验结果看，水饱和正丁醇萃取、大孔树脂纯化、固相萃取、薄层色谱纯化可以大幅度去除杂质，其中薄层色谱纯化的样品最好，考虑到实验的简便、准确、重复性，最终选择固相萃取纯化的样品，结合梯度洗脱、流速变化、低柱温的色谱条件，取得相对满意的结果。

表1 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1回收率
Tab. 1 Recoveries of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1

表2 样品含量测定结果(n=3)
Tab. 2 Results of sample determination(n=3) mg

本实验考察了 ZORBAX SB-C18和 Inertsil ODS-3色谱柱，取得了一致的结果。本实验中，柱温对色谱峰的影响明显，短柱在25 ℃以下可以获得良好分离度，35 ℃以上目标峰不能完全分离，结合色谱柱承受温度及分离度，确定柱温为20 ℃，取得良好效果。

[1] 国家食品药品家督管理局发布. 国家药品标准[S]：WS-10115(ZD-0115)-2002-2012Z.

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SUN Rongfei1, ZHANG Jinxi1, ZHAO Xiaoxing1, ZHE Congzhang2(1.Zhaotong Institute of Food and Drug Control,Zhaotong 657000, China; 2.YongZitang Pharmaceutical Company Limited, Zhaotong 657000,China)

ABSTRACT:OBJECTIVE To augment evaluation index, and establish a scientific and reasonable method for the content determination of Baibei Yifei capsule. METHODS Samples were purified by C18column, optimized chromatographic conditions： Vp-ODS column (150 mm×4.6 mm, 5 μm); column temperature： 20 ℃; fluctuan flow rate; the mobile phase acetonitrile (A)-water (B), gradient elution. The injection volume was 10 μL. The detection wavelength was 203 nm. RESULTS The contents of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1, ginsenoside Rb1were linear in 40.24-241.44(r=0.999 6), 91.50-549.00(r=0.999 9), 35.72-241.32(r=0.999 8)μg·mL-1, respectively. The recovery rate was 94.15%-99.81%, RSD was 1.12%-1.94%.CONCLUSION The method is accurate and reproducible, which can provide the basis for the revision of the standard.

引用本文：孙荣飞, 张金玺, 赵晓星, 等. 百贝益肺胶囊含量测定的方法改进[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(12)： 1740-1742.

作者简介：孙荣飞，男，主管药师 Tel： (0870)3156089 E-mail： 286707498@163.com