HPLC测定D-对羟基苯甘氨酸甲酯中的手性杂质

摘要：目的建立HPLC测定D-对羟基苯甘氨酸甲酯中潜在的手性杂质[杂质1：L-对羟基苯甘氨酸，杂质2：L-对羟基苯甘氨酸甲酯，杂质3：D-对羟基苯甘氨酸]的含量和限度。方法采用Crownpak CR(-)手性色谱柱(150 mm×4.0 mm，5 μm)；流动相：高氯酸溶液(pH 1.7)-甲醇(90∶10)；检测波长为226 nm；流速：0.7 mL·min-1；柱温：25 ℃。结果杂质1、杂质2和杂质3均在其定量限浓度～2.400 μg·mL-1内线性良好(r分别为1.000 0，0.999 9，0.999 9)，平均回收率分别为99.97%，100.30%和103.18%，RSD分别为0.30%，0.64%和0.62%(n=9)。结论该方法专属性强，准确、方便，可以作为D-对羟基苯甘氨酸甲酯中手性杂质1、杂质2和杂质3的液相分析方法。

关键词：D-对羟基苯甘氨酸甲酯；手性杂质；高效液相色谱法

D-对羟基苯甘氨酸甲酯是一种重要的医药中间体，用于制备羟氨苄青霉素、羟氨苄头孢菌素和羟氨唑头孢菌素等 β-内酰胺类抗菌药物，同时它也用于多种多肽类激素及农药的合成[1]。作为中间体，其中的手性杂质参与反应，易造成后续API中产生手性杂质，而国内外对其手性杂质的拆分鲜有文献报道，仅有通过 HPLC对对羟基苯甘氨酸甲酯中L-对羟基苯甘氨酸甲酯拆分的研究[2]。文献报道有对对羟基苯甘氨酸光学异构体的拆分，但用到的方法是化学拆分法，优先结晶法等，并未采用HPLC拆分[3]。本实验通过HPLC测定D-对羟基苯甘氨酸甲酯中的手性杂质 L-对羟基苯甘氨酸(杂质 1)、L-对羟基苯甘氨酸甲酯(杂质 2)和D-对羟基苯甘氨酸(杂质3)，对D-对羟基苯甘氨酸甲酯进行质量考察。

1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；UV2550紫外可见分光光度计(日本岛津公司)；Crownpak CR(-) 手性色谱柱(150 mm×4.0 mm，5 μm)(大赛璐公司)。

D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品(山东汉兴医药科技有限公司，批号：1007-1609105，1007-1609106，1007-1609107)；杂质1：L-对羟基苯甘氨酸对照品(批号：6-JNT-5H，含量：98.0%)、杂质 2：L-对羟基苯甘氨酸甲酯对照品(批号：169317L-HB-08，含量：83.69%)购自深圳斯坦德化工科技有限公司；杂质 3：D-对羟基苯甘氨酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：130435-200502，含量：99.4%)；D-对羟基苯甘氨酸甲酯对照品(深圳斯坦德化工科技有限公司，批号：163317D-HB-08，含量：83.68%)。高氯酸为分析纯(天津市东方化工厂)；甲醇为色谱纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Crownpak CR(-)手性色谱柱(150 mm×4.0 mm，5 μm)；流动相：高氯酸溶液(pH1.7)-甲醇(90∶10)；检测波长：226 nm；流速：0.7 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：20 µL。

2.2 溶液的配制

杂质1溶液：精密称取杂质1 10 mg，加流动相溶解并定容至50 mL，作为杂质1贮备液；精密量取上述溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，浓度为0.002 mg·mL-1杂质1溶液。杂质2、杂质3溶液的配制同杂质1。

D-对羟基苯甘氨酸甲酯对照溶液：精密称取D-对羟基苯甘氨酸甲酯对照品10 mg，加流动相溶解并定容至50 mL，作为对照贮备液；精密量取上述溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，浓度为0.002 mg·mL-1。

系统适用性溶液：精密量取杂质1、杂质2、杂质 3和D-对羟基苯甘氨酸甲酯对照贮备液各1 mL，置100 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得，浓度为0.002 mg·mL-1。

供试品溶液：精密称定D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品10 mg，置50 mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 检测波长选择

通过仪器全波长扫描，D-对羟基苯甘氨酸甲酯和D-对羟基苯甘氨酸的最大吸收波长均在(226±2)nm，因此选择最佳检测波长为226 nm。

2.4 流动相选择

由于杂质1、杂质2、杂质3及D-对羟基苯甘氨酸甲酯在水中的溶解度较小，易溶于酸性溶液中，本实验比较了 pH值为 2.0，1.9，1.8，1.7，1.6的高氯酸溶液-甲醇(95∶5)的流动相对分离度的影响，结果显示当高氯酸溶液的pH值为1.7时分离度较好，但杂质 2峰形中包裹空白溶液中的溶剂峰，pH值继续降低分离度改善不大且不能将杂质 2与空白溶液中的溶剂峰分离，故对高氯酸溶液-甲醇的比例进行优化。该色谱柱明确规定有机溶剂只能用甲醇，体积比要＜15%。优化确定高氯酸溶液(pH 1.7)-甲醇(90∶10)作为流动相，溶剂峰对杂质2无干扰，且主峰与这3种杂质能达到有效分离。

2.5 系统适用性试验

取空白溶液、系统适用性溶液和供试品溶液各20 µL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1。在该色谱条件下出峰顺序依次为L-对羟基苯甘氨酸、L-对羟基苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸和D-对羟基苯甘氨酸甲酯。各杂质及其相邻峰之间的分离度＞1.5，主峰与这3种杂质能达到有效分离，空白溶剂不干扰测定。结果见表1。

图1 HPLC色谱图
A-空白溶液；B-系统适用性溶液；C-供试品溶液；1-L-对羟基苯甘氨酸；2-L-对羟基苯甘氨酸甲酯；3-D-对羟基苯甘氨酸；4-D-对羟基苯甘氨酸甲酯。
Fig. 1 HPLC chromatograms
A-blank; B-system solution; C-sample solution; 1-L-hydroxy phenyl glycine; 2-L-hydroxyphenylglycine methyl ester; 3-D-hydroxy phenyl glycine; 4-D-hydroxy phenyl glycine methyl ester.

表1 系统适用性试验结果
Tab. 1 Results of system applicability test

2.6 耐用性试验

精密吸取系统适用性溶液和供试品溶液，分别在流速变化(±0.1 mL·min-1)、色谱柱温度变化(±5 ℃)、检测波长变化(±5 nm)、流动相比例变化(±20%)等色谱条件下进行测定。测得系统适用性均满足要求，杂质1、杂质2、杂质3含量变化均＜±0.1%。结果表明在其他条件不变的前提下，流速、柱温、检测波长、流动相比例的微小变化对样品中手性杂质含量测定和色谱峰分离均无明显的影响，说明该方法的耐用性较好。

2.7 检测限与定量限

分别取杂质1、杂质2和杂质3贮备液，用流动相逐级稀释成不同浓度，按“2.1”项下色谱条件分别进样检测，观察色谱峰与噪声的响应，测得检测限(信噪比(S/N)=3)和定量限(信噪比(S/N)=10)。取定量限溶液重复进样 6次，计算主峰峰面积的RSD值作为定量限重复性的结果。检测限、定量限及定量限重复性试验结果见表2。

表2 检测限、定量限及定量限重复性试验结果
Tab. 2 Result of LOD, LOQ and LOQ repeatability test

2.8 线性试验

分别精密称取杂质1、杂质2和杂质3贮备液，加流动相稀释制成定量限～120%杂质溶液浓度的溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样检测，记录色谱图。以浓度(x)对峰面积(y)作线性回归，回归方程及相关系数(r)见表3。结果表明在此范围内其线性关系良好。

表3 线性试验结果
Tab. 3 Result of the linear test

2.9 仪器精密度试验

分别精密量取杂质1、杂质2和杂质3溶液，重复进样6次，计算其峰面积的RSD(n=6)分别为0.08%，0.09%，0.26%，表明仪器精密度良好。

2.1 0 中间精密度试验

按“2.1”项下方法于不同时间、不同仪器及不同操作人员，取D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品(批号：1007-1609105)，平行制备 6份供试品溶液进行测定，计算手性杂质峰面积 RSD；按面积归一化法计算供试品溶液手性杂质含量RSD值。重复性试验中杂质2和杂质3峰面积的RSD(n=6)分别为 2.75%和 6.56%，手性杂质含量 RSD(n=6)分别为0.29%和3.45%。中间精密度试验中杂质2和杂质3峰面积的RSD(n=12)分别为3.44%和5.28%，手性杂质含量RSD(n=12)分别为0.32%和5.29%。供试品溶液中均未检出L-对羟基苯甘氨酸。说明该方法精密度较高。

2.1 1 稳定性试验

将供试品溶液于4 ℃条件下放置，分别于0，1，2，4，6，8，12 h，按“2.1”项条件进样检测。杂质2和杂质3峰面积的RSD(n=7)分别为0.44%和12.95%，手性杂质含量变化绝对值分别为0和0.05%，供试品溶液中未检出杂质1。表明供试品溶液在4 ℃条件下12 h内稳定性良好。

2.1 2 回收率试验

取D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品(批号：1007-1609105)20 mg与100 mL量瓶中，分别加入杂质1、杂质2和杂质3贮备液0.8，1.0和1.2 mL，作为加样回收溶液，即 80%，100%和 120%的回收率溶液(n=9)。杂质1、杂质2和杂质3的平均回收率分别为99.97%，100.30%和103.18%，RSD分别为0.30%，0.64%和0.62%。表明其回收率好。

2.1 3 样品的测定

取3批D-对羟基苯甘氨酸甲酯样品，按“2.2”项下的供试品溶液进行配制，进样检测，以面积归一化法计算含量。结果见表4。

表4 样品测定结果
Tab. 4 Result of the determination of sample %

3 讨论

本实验采用 Crownpak CR(-)手性色谱柱，以高氯酸溶液(pH 1.7)-甲醇(90∶10)为流动相，能够有效检测D-对羟基苯甘氨酸甲酯中手性杂质 1、杂质2和杂质3的含量。该方法专属性强，准确、方便，为D-对羟基苯甘氨酸甲酯及相关药品质控提供了重要的科学依据。

[1] TAKAHASLI S, OHASAI T, KII Y, et al. Microbiatransformation of hydantoins toN-carbamyl-D-amino acids [J].J Ferment Technol, 1979, 57( 4)： 328.

[2] LI C P. High performance liquid chromatographic separation of drug enantiomer using chiral mobile phase additives [D].Hangzhou： Pharmaceutical Science College, Zhejiang University of Technology, 2003.

[3] 任国宾, 詹予忠, 陈宜俍, 等. 对羟基苯甘氨酸的合成及拆分技术进展[J]. 精细化工中间体, 2002, 32(1)： 8-11.

Determination of Chiral Impurities in D-hydroxyphenylglycine Methyl Ester by HPLC

LIU Ping, ZHANG Suoqing*, ZHANG Wensheng, GUO Jinli, JIAO Yunfei, SUN Yushuang
(NCPC Hebei Pharma Co., Ltd., Shijiazhuang 052165, China)

ABSTRACT:OBJECTIVE To establish a method of HPLC to determine the limit and content of potential chiral impurities：L-hydroxy phenyl glycine (impurity 1), L-hydroxyphenylglycine methyl ester (impurity 2) and D-hydroxyphenylglycine(impurity 3) in active pharmaceutical substance D-hydroxyphenylglycine methyl ester qualitatively and quantitatively.METHODS A Crownpak CR(-) chiral column (150 mm×4.0 mm, 5 μm) was used, with perchlorate solution (pH 1.7)-methanol (90∶10) as the mobile phase with a flow rate at 0.7 mL·min-1. The detection wavelength was 226 nm, and the temperature of column was 25 . ℃RESULTS The calibration curve for impurity 1, impurity 2 and impurity 3 were well linear in the range of LOQ concentration-2.400 μg·mL-1(r were 1.000 0, 0.999 9 and 0.999 9, respectively). Average recoveries for impurity 1, impurity 2 and impurity 3 were 99.97%, 100.30% and 103.18%, and RSDs were 0.30%, 0.64% and 0.62% (n=9),separately. CONCLUSION The method is highly specific, accurate and convenient, it can be used for the quality control of the chiral impurities 1, impurities 2 and impurities 3 of D-hydroxyphenylglycine methyl ester.

引用本文：刘萍, 张锁庆, 张文胜, 等. HPLC测定 D-对羟基苯甘氨酸甲酯中的手性杂质[J]. 中国现代应用药学, 2017,34(12)： 1731-1733.

作者简介：刘萍，女，硕士，工程师 Tel： (0311)88152553 E-mail： lp5391253@126.com*

通信作者：张锁庆，男，硕士，高级工程师Tel： (0311)88152865 E-mail： zhangsqing@163.com