刘倩倩1，谢子立2*
(1.安徽中医药大学药学院，合肥 230012；2.安徽省食品药品检验研究院，合肥 230051)
摘要：目的 建立 HPLC双波长法测定复方罗布麻片Ⅰ中泛酸钙和氢氯噻嗪的含量。方法 采用 Kromasil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以含0.1%辛烷磺酸钠溶液(用磷酸调节pH值至3.0)-乙腈(96∶4)为流动相A，以甲醇为流动相B，采用梯度洗脱，柱温为35 ℃，检测波长泛酸钙200 nm、氢氯噻嗪275 nm，流速为1.0 mL·min-1，进样量为10 μL。结果 泛酸钙和氢氯噻嗪分别在0.025～0.5 μg(r=0.999 6)和0.16～3.2 μg(r=1.000 0)内线性关系良好；平均加样回收率(n=9)分别为101.2%(RSD=0.47%)和101.6%(RSD=0.49%)。结论 本法精密度好，结果准确可靠，适用于该制剂的质量检验分析。
关键词：复方罗布麻片Ⅰ；泛酸钙；氢氯噻嗪；高效液相色谱法
复方罗布麻片Ⅰ是由罗布麻叶、野菊花、防己以及硫酸双肼屈嗪、氢氯噻嗪等多味中西药组成的复方制剂[1-2]，为治疗高血压病的常用药物，临床应用多年，效果明显[3]。其中泛酸钙为钙离子拮抗剂，抑制钙离子内流，减少血管平滑肌的张力及其对内源性加压物质的反应性，而产生降压作用；氢氯噻嗪为利尿降压药，能增加硫酸双肼屈嗪的降压作用以及降低水钠潴留的不良反应[4]。复方罗布麻片Ⅰ收载于国家药品标准化学药品地标升国标第十一册[5]，现行标准中只收载了氢氯噻嗪[6]的含量测定，该质量标准过于简单，未对泛酸钙的含量进行控制，不利于药物的质量控制。本实验同时测定复方罗布麻片Ⅰ中的泛酸钙和氢氯噻嗪含量，为复方罗布麻片Ⅰ的标准制订提供参考[7]。
LC-20AD系列高效液相色谱仪(日本岛津公司)；AG-135电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；泛酸钙对照品(批号：100370-201402，纯度：97.5%)、氢氯噻嗪对照品(批号：100309-201103，纯度：99.8%)均来自中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇均为色谱纯(美国Fisher公司)；辛烷磺酸钠为离子对色谱用试剂(美国天地有限公司)；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。复方罗布麻片Ⅰ(厂家A，批号：151003；厂家B，批号：151231；厂家C，批号：150502；厂家D，批号：140301)。
采用 Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；0.1%辛烷磺酸钠溶液(用磷酸调节 pH值至3.0)-乙腈(96∶4)为流动相 A，甲醇为流动相 B，梯度洗脱(0～15 min，99%A；15～30 min，99%→45%A；30～40 min，45%→10%A；40～40.1 min，10%→99%A；40.1～70 min，99%A)。柱温 35 ℃，检测波长：泛酸钙200 nm，氢氯噻嗪275 nm，流速 1.0 mL·min-1，进样量 10 μL。
2.2.1 对照品储备液的制备 分别精密称取泛酸钙对照品、氢氯噻嗪对照品适量，加流动相 A-甲醇(20∶80)混合溶液使溶解并稀释制成每1 mL含0.125 mg的泛酸钙和0.8 mg的氢氯噻嗪混合溶液，作为对照品储备液。
2.2.2 混合对照品溶液的制备 精密量取“2.2.1”项下的对照品储备液5 mL置25 mL量瓶中，加流动相A-甲醇(20∶80)混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备 取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量(约相当于氢氯噻嗪4 mg)置25 mL量瓶中，加流动相A-甲醇(20∶80)混合溶液适量超声20 min使溶解，用流动相A-甲醇(20∶80)混合溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
2.2.4 阴性对照溶液的制备 按处方比例制备不含泛酸钙、氢氯噻嗪的阴性对照溶液，按“2.2.3”项下的方法同法处理。
分别取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样10 μL测定。结果显示，阴性对照溶液不干扰混合对照品和供试品溶液的测定，见图1。
精密吸取“2.2.1”项下的对照品储备液0.5，1，3，5，7，10 mL，分别置25 mL量瓶中，用流动相A-甲醇(20∶80)混合溶液稀释至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液 10 μL，分别注入液相色谱仪中，按“2.1”项下色谱条件进行测定，分别以相应对照品的浓度(X)为横坐标，以泛酸钙、氢氯噻嗪峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得泛酸钙、氢氯噻嗪回归方程分别为：Y=10×105X-2 016.4(r=0.999 9)，Y=4×106X+10 261(r=1.000 0)，结果表明：泛酸钙和氢氯噻嗪的线性范围分别为0.025～0.5 μg 和 0.16～3.2 μg，线性关系良好。
图1 高效液相色谱图
A-混合对照品溶液(200 nm)；B-混合对照品溶液(275 nm)；C-供试品溶液(200 nm)；D-供试品溶液(275 nm)；E-阴性对照溶液(200 nm)；F-阴性对照溶液(275 nm)；1-泛酸钙；2-氢氯噻嗪。
Fig. 1 HPLC chromatograms
A-standard solution(200 nm); B-standard solution(275 nm); C-sample solution(200 nm); D-sample solution(275 nm); E-negative solution(200 nm); F-negative solution(275 nm); 1-calcium pantothenate;2-hydrochlorothiazide.
以信噪比(S/N)为3∶1和10∶1为基准测得各化合物的检测限和定量限，泛酸钙的检测限为1.0 ng，定量限为3.3 ng；检测限是由线性范围最低的浓度(0.002 5 mg·mL-1)稀释25倍所得最终浓度为 0.000 1 mg·mL-1；氢氯噻嗪的检测限为0.4 ng，定量限为1.3 ng；检测限是由线性范围最低的浓度(0.016 mg·mL-1)稀释 400倍所得最终浓度为 0.000 04 mg·mL-1。
分别精密量取“2.2.2”项下的混合对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，连续测定6次，记录峰面积，泛酸钙、氢氯噻嗪的RSD分别为0.31%(n=6)和0.10%(n=6)，结果表明仪器精密度良好。
取“2.2.3”项下供试品溶液，室温放置，分别取0，4，8，12，16，20，24 h的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱峰面积，泛酸钙、氢氯噻嗪的 RSD分别为 0.29%(n=7)和0.12%(n=7)，结果表明24 h内供试品溶液稳定性良好。
取同一批供试品(批号：151003)6 份，按照“2.2.3”项下方法平行制备 6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，记录色谱峰面积，结果泛酸钙、氢氯噻嗪的RSD分别为0.84%(n=6)和0.44%(n=6)，结果表明本法重复性良好。
采用加样回收法，取已知含量的同一批复方罗布麻片Ⅰ，研细，精密称取约相当于2.5片的量，置50 mL量瓶中，共9份，依次每3份分别加入对照品的量为样品含量的 40%，50%及 60%，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定，结果见表1。
表1 加样回收率实验结果(n=9)
Tab. 1 Results of recovery tests (n=9)
分别取不同厂家的复方罗布麻片Ⅰ，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再分别精密量取供试品溶液和对照品溶液10 μL进样，测定峰面积，按外标法计算含量，结果见表2。
表2 复方罗布麻片Ⅰ中泛酸钙和氢氯噻嗪的含量(n=4)
Tab. 2 The contents of calcium pantothenate and hydrochlorothiazide in Compound Kendir Leaves tablet Ⅰ(n=4)
按照中国药典[8]及相关文献[9-11]，虽然泛酸钙易溶于水，但氢氯噻嗪在水中不溶，乙醇中微溶，甲醇中溶解，由于溶剂[流动相 A-甲醇(20∶80)混合溶液]中含甲醇比例较大，故可用该溶剂直接稀释定容。泛酸钙在溶液中易于离子化，反相色谱中很难在C18柱上保留，采用在流动相中加入离子对试剂辛烷磺酸钠，使其与泛酸钙中的离子结合生成弱极性的化合物，从而加大在固定相中的保留，有效地与其他杂质分开。
复方罗布麻片Ⅰ作为一种典型的由多味中西药组成的复方制剂，为避免制剂中有效成分无法完全溶出，对供试品超声时间做了比较，以超声时间(min)为横坐标，以泛酸钙和氢氯噻嗪的百分含量(%)为纵坐标，结果见图 3。由图可知，泛酸钙和氢氯噻嗪在超声15～25 min时基本完全溶解，在超声30 min后泛酸钙含量略微下降，因此建议超声20 min，确保样品能完全溶解并稳定。
图3 泛酸钙和氢氯噻嗪超声时间的选择
Fig. 3 The choose of ultrasonic time about calcium pantothenate and hydrochlorothiazide
泛酸钙在230 nm以上无紫外发色基团，通过测定泛酸钙的紫外吸收光谱，发现泛酸钙最大吸收在195 nm。色谱条件中流动相为缓冲溶液与甲醇进行梯度洗脱，甲醇的截至波长为205 nm，测定波长的选择存在一定难度。经色谱条件中梯度洗脱表可知，在泛酸钙出峰时间时，甲醇的比例仅占 1%，即为流动相 A-甲醇(99∶1)，甲醇的截止波长对泛酸钙在200 nm下测定无干扰。为考察本次实验耐用性，避免不同仪器造成的差异，以流动相A-甲醇(95∶5)为考察泛酸钙截止波长的梯度洗脱溶液，经紫外扫描截止波长为190 nm以下，而在 195～240 nm 之间紫外吸收为 0.357 4～0.073 0，其中200 nm的紫外吸收为0.189 5，能有效避免甲醇截止波长对泛酸钙测定的影响。文献报道泛酸钙的检测波长多在210 nm，经实验知，该色谱条件下210 nm[12]处的峰面积比195 nm处的低了近三分之一，由于泛酸钙含量较低，不利于该组分的准确积分，而200 nm处的峰面积只略低于195 nm，且积分准确性高(RSD=0.35%，n=6)，同时有效避免流动相基线噪音及样品中其他成分造成的干扰[13]，最终选择200 nm作为泛酸钙的检测波长。
氢氯噻嗪的最大吸收波长经紫外扫描可知为271 nm，由图1可知，200 nm处色谱中20 min后开始出现末端吸收，故氢氯噻嗪的检测波长不选择200 nm。由于处方中氢氯噻嗪的加入量为泛酸钙的64倍，在低波长处氢氯噻嗪的吸收值过高。参考相关文献[14]且制剂中的辅料在 275 nm 无干扰，因此采用275 nm作为氢氯噻嗪的检测波长。综上，最终选择双波长法[15]测定复方罗布麻片Ⅰ中的泛酸钙(200 nm)和氢氯噻嗪(275 nm)的含量。
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Determination of Calcium Pantothenate and Hydrochlorothiazide in Compound Kendir Leaves Tablet Ⅰ by Dual Wavelengths of HPLC
LIU Qianqian1, XIE Zili2*
(1.School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230012, China; 2.Anhui Institute for Food and Drug Control, Hefei 230051, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To establish a dual wavelengths of HPLC method for the determination of calcium pantothenate and hydrochlorothiazide in Compound Kendir Leaves tablet Ⅰ. METHODS The Kromasil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm) was used with the mobile phase A [0.1% octane sulfonic acid sodium (adjust pH to 3.0 with phosphoric acid)-acetonitrile (96∶4)]-methanol as mobile phase B with gradient elution. The column temperature was set as 35 ℃ a nd the detection wavelength was set at 200 nm for calcium pantothenate and 275 nm for hydrochlorothiazide. The flow rate was 1.0 mL·min-1and the injection volume was 10 μL. RESULTS The linear range was good within 0.025-0.5 μg (r=0.999 6) for calcium pantothenate,0.16-3.2 μg(r=1.000 0) for hydrochlorothiazide, respectively. The average recoveries(n=9) were 101.2% (RSD=0.47%) and 101.6% (RSD=0.49%), respectively. CONCLUSION The method is accurate and reliable for the quality control of this compound preparation.
KEY WORDS:Compound Kendir Leaves tablet I; calcium pantothenate; hydrochlorothiazide; HPLC
REFERENCES
中图分类号：R917.101
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2017)12-1668-04
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.12.005
引用本文：刘倩倩, 谢子立. HPLC双波长法测定复方罗布麻片Ⅰ中泛酸钙和氢氯噻嗪的含量[J]. 中国现代应用药学, 2017,34(12)： 1668-1671.
基金项目：国家重大科学仪器设备开发专项项目(2013YQ220643)
作者简介：刘倩倩，女，硕士生 Tel： 18356063357 E-mail： 1137026954@qq.com*
通信作者：谢子立，男，副主任药师 Tel：(0551)63358051 E-mail： 1536838165@qq.com
收稿日期：2017-05-16
(本文责编：李艳芳)