图 1 达沙替尼结构式
Fig. 1 Structure of dasatinib
汪进良，冯泽旺，赵宣
(天津键凯科技有限公司，天津 300462)
摘要：目的 合成2种聚乙二醇-达沙替尼结合物(JK120303和JK120304)，并评价结合物JK120303和JK120304在K562人慢性髓系白血病皮下瘤模型中的抗肿瘤作用。方法 将达沙替尼用缬氨酸衍生后分别和mPEG-二肽酸和4arm-PEG-乙酸反应得到聚乙二醇-达沙替尼结合物，于NOD/SCID小鼠右侧背部皮下接种K562细胞，建立人慢性髓系白血病异种移植动物皮下模型，根据相对肿瘤增殖率进行疗效评价。结果 合成得到 2个聚乙二醇-达沙替尼结合物。结合物JK120303(2.5 mg·kg-1和 5 mg·kg-1)的药效优于达沙替尼(5 mg·kg-1)，结合物 JK120304(2.5 mg·kg-1和 5 mg·kg-1)的药效与达沙替尼(5 mg·kg-1)相当。结论 聚乙二醇-达沙替尼结合物JK120303药效优于达沙替尼，值得进一步研究。
关键词：达沙替尼；聚乙二醇-达沙替尼结合物；合成；药效
慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是一种影响血液及骨髓的恶性增殖性疾病，一般自然起始于“慢性期”，之后经过“加速期”，最终到“急变期”。急变期是CML的最终阶段，与急性白血病相似，具有较强致死性[1]。在CML的治疗中，伊马替尼是首选的酪氨酸激酶抑制剂，伊马替尼与ABL 激酶的ATP 结合位点结合产生抑制作用，对于野生型的BCR-ABL 激酶的作用效果良好，而对突变型的效果不佳，而许多肿瘤细胞BCR-ABL激酶区存在突变，导致很多患者对伊马替尼产生耐药性[2]。达沙替尼可以阻断多种致癌蛋白，于2007年经过FDA的批准用于既往治疗失败或不耐受的CML的所有病期患者，同时还用于治疗对其他疗法耐药或不耐受的费城染色体阳性的急性淋巴细胞性白血病成人患者[3]，达沙替尼结构式见图1。
图 1 达沙替尼结构式
Fig. 1 Structure of dasatinib
临床试验表明，达沙替尼的疗效超过高剂量伊马替尼的疗效，且未发现耐药性，但在使用过程中，仍存在发热、胸膜积液、发热性中性粒细胞减少、胃肠道出血、肺炎、血小板减少、呼吸困难、贫血、腹泻和心脏衰竭等不良反应[4]。此外，FDA还于2011年10月公告了达沙替尼可能会增加肺动脉高压的风险，并决定将这一风险信息添加到扑瑞赛药品说明书的警告与注意事项当中[4]。
对达沙替尼及其衍生物进行相应的修饰有助于增加其疗效，降低可能的不良反应。聚乙二醇(PEG)修饰技术是一种将 PEG活化后连接到药物分子或表面的技术。药物小分子经过PEG修饰，特别是大分子量PEG修饰后，可以增加水溶性，降低毒性，减少酶降解作用，提高生物利用度[5]。相对于直链型PEG，单臂多头PEG和多臂PEG具有多个端基，进而具有多个药物连接点、可以负载多个药物分子的优势。本研究分别选取大分子量的单甲氧基 PEG谷氨酸二肽酸(mPEG-二肽酸)和四臂PEG乙酸(4arm-PEG-乙酸)经氨基酸连接臂和达沙替尼反应，得到结合物 JK120303和JK120304, 所得到的化合物为大分子量PEG衍生物，是一种前药，易溶于水，一般制成冻干粉针，以注射形式给药。药物进入到体内后因为有 PEG的键合，裂解比较缓慢，大部分到达靶标位置后再裂解出原药形式，发挥药理作用，这样比口服所需给药次数少，药物能平缓地释放出来，也有利于减少不良反应。本实验随后在NOD/SCID小鼠右侧背部皮下接种K562细胞，建立人慢性髓系白血病异种移植动物皮下模型，根据相对肿瘤增殖率(T/C%)对化合物进行药效评价。
Advance 300 MHz型核磁共振仪(瑞士Bruker公司)；Autoflex III型飞行时间质谱仪(瑞士Bruker公司)；WRS-2A数字熔点仪(上海申光仪器有限公司)。
达沙替尼(南京安格医药化工有限公司，批号：130523，质量分数：99%)；N-叔丁氧羰基缬氨酸(国药集团北京化学试剂有限公司，批号：130607，质量分数：99%)；单甲氧基PEG谷氨酸二肽酸(天津键凯科技有限公司，批号：ZZ105P060，分子量：20 000，质量分数：95%)；四臂PEG乙酸(天津键凯科技有限公司，批号：ZZ101P095，分子量：20 000，质量分数：95%)；其余试剂均为市售分析纯。
NOD/SCID小鼠，实验动物许可证号：SCXK(京)2009-0004，SPF级，♀♂各半，体质量：20～24 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司(HFK)。
合成路线见图2。
2.1.1 化合物 3的制备 将达沙替尼 1.95 g(4 mmol)，N-叔丁氧羰基缬氨酸840 mg(4.8 mmol)和DMAP 714 mg(4.8 mmol)加到反应瓶中，用40 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，氮气保护下冰浴冷却，再滴入DCC 1.03 g (5 mmol) 溶于20 mL二氯甲烷的溶液，滴完后自然升到室温反应过夜。TLC监测反应完全后减压蒸去溶剂，残分用柱层析分离，得N-叔丁氧羰基甘氨酸达沙替尼酯1.5 g，收率为58%。
图2 PEG-达沙替尼结合物的合成路线
Fig. 2 Synthetic route of PEG-dasatinib conjugates
2.1.2 化合物4的制备 将N-叔丁氧羰基缬氨酸达沙替尼酯(化合物 3)1 g(1.6 mmol)，二氯甲烷50 mL，加到反应瓶中，再加入三氟乙酸25 mL，搅拌反应3 h后减压蒸去溶剂，残分中加入二氯甲烷，减压蒸干，如此重复 3次，得缬氨酸达沙替尼酯三氟乙酸盐 0.9 g，直接往下反应。
2.1.3 化合物6的制备 将单甲氧基PEG谷氨酸二肽酸(0.5 g，0.025 mmol)，缬氨酸达沙替尼酯三氟乙酸盐 140 mg (0.15 mmol)，HOBt 3.4 mg(0.025 mmol)和 DMAP 24.4 mg(0.2 mmol) 加到反应瓶中，用二氯甲烷和 N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂溶解, 氮气保护下冰浴冷却，再滴入 DCC 36.1 mg(0.175 mmol) 溶于二氯甲烷的溶液，滴完后自然升温反应过夜。次日将反应液浓缩，残分用异丙醇重结晶，得单甲氧基PEG谷氨酸二肽缬氨酸-达沙替尼结合物(JK120303)0.32 g。
2.1.4 化合物 8的制备 将 PEG四臂酸(0.5 g，0.025 mmol)，缬氨酸达沙替尼酯三氟乙酸盐140 mg(0.15 mmol)，HOBt 3.4 mg(0.025 mmol) 和DMAP 24.4 mg(0.2 mmol) 加到反应瓶中，用二氯甲烷和 N,N-二甲基甲酰胺混合溶剂溶解，氮气保护下冰浴冷却，再滴入DCC 36.1 mg(0.175 mmol)溶于二氯甲烷的溶液，滴完后自然升温反应过夜。次日将反应液浓缩，残分用异丙醇重结晶，得四臂PEG乙酸-达沙替尼结合物(JK120304)0.32 g。
K562细胞系在补充了10%胎牛血清，L-谷氨酰胺(2 mmol·kg-1)的 RPMI-1640培养基中，于37 ℃，空气中含5% CO2的条件下体外培养。肿瘤细胞每周常规传代 2次。收集处于指数生长期的肿瘤细胞，悬于等体积的 PBS：基质胶混合物中，置于冰上，用于肿瘤接种。
于 NOD/SCID小鼠右侧背部皮下接种 K562细胞，建立人慢性髓系白血病异种移植动物皮下模型。定期观察肿瘤生长情况，待肿瘤生长至平均130 mm3时根据肿瘤大小和小鼠体质量随机分组并开始给药治疗。实验小鼠分为溶剂对照组、达沙替尼组、受试药物JK120303(2.5，5 mg·kg-1)和JK120304(2.5，5 mg·kg-1)组，共6组，每组8只，静脉注射给药，1周2次。
每周测量 2次小鼠的体质量和肿瘤的大小，根据T/C%进行疗效评价。肿瘤大小计算公式：V=0.5×(d肿瘤长径×d肿瘤短径2)。根据实验组和对照组肿瘤体积大小，计算相对肿瘤体积(RTV)和治疗组与对照组相对肿瘤体积的百分比值(T/C)。实验结果以平均瘤体积±SE(标准误差)表示，统计分析时，相对肿瘤体积数据在统计时方差不齐，使用单因素方差分析(one-way ANOVA)及Dunnett T3多重比较方法对各组间进行相对肿瘤体积显著性差异的比较，p＜0.05为差异有统计学意义。
化合物 3，白色固体，熔点：228～230 ℃；1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)：δ 1.02 (d，6H，CH3)，1.21 (s，9H，CH3)，2.23(s，3H，ArCH3)，2.49(s，3H，Pyr-CH3)，2.68 (m，6H，NCH2)，3.12(m，1H，CH)，3.26(m，4H，CH)，4.28(m，2H，OCH)，4.52(d，1H，CH)，6.04(s，1H，Pyr-H)，7.27(m，2H，ArH)，7.40(m，1H，ArH)，8.22(s，1H，=CHN=)，9.88(s，1H，NHCO)，11.48(s，1H，NHCO)。
化合物 6，白色固体，熔点：57～58 ℃；1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)：δ 0.91(d，18H，CH3)，2.23(s，9H，ArCH3)，2.40 (s，9H，Pyr-CH3)，3.51(m，～1800H，OCH2)，6.04(s，3H，Pyr-H)，7.27(m，6H，ArH)，7.40(m，3H，ArH)，8.22(s，3H，=CHN=)，9.88(s，3H，NHCO)，11.47(s，3H，NHCO)；MALDI-TOF MS：MW22 466，Mn 22473，Pd=1。
化合物 8，白色固体，熔点：50～51 ℃；1H-NMR(DMSO-d6，300 MHz)：δ 0.91(d，24H，CH3)，2.23(s，12H，ArCH3)，2.40 (s，12H，Pyr-CH3)，3.50(m，～1800H，OCH2)，6.04(s，4H，Pyr-H)，7.27(m，8H，ArH)，7.40(m，4H，ArH),7.70(m，4H，ArH)，8.22(s，4H，=CHN=)，9.88(s，1H，NHCO),11.48(s，4H，NHCO)；MALDI-TOF MS：MW22 855，Mn 22 866，Pd=1。
3.2.1 体质量变化 小鼠给予不同剂量药物后的体质量变化曲线见图3。
实验各组除溶剂对照组到第14天因平均肿瘤体积＞2 000 mm3处死外，其余各组体质量呈平稳增长趋势，表明能耐受所给药物的剂量。
3.2.2 肿瘤体积变化 肿瘤体积变化情况见表1～2。
图3 不同剂量药物给药后小鼠体质量变化
Fig. 3 The variation of mice weight after different doses of drugs were administered
表1 各治疗组肿瘤体积T/C%值(与溶剂对照组比较)
Tab. 1 The T/C%(vsthat in solvent control group) of tumor volume in each treatment group
注：与溶剂对照组相比，1)P＜0.001。
Note： Compared with control group,1)P＜0.001
表2 各治疗组肿瘤体积T/C%值(与达沙替尼组比较)
Tab. 2 The T/C%(vsthat in dasatinib group) of tumor volume in each treatment group
注：与达沙替尼组相比，1)P＜0.001。
Note： Compared with dasatinib group,1)P＜0.001
与溶剂对照组相比，阳性药物达沙替尼(5 mg·kg-1)、结合物 JK120303(2.5，5 mg·kg-1)和JK120304(2.5，5 mg·kg-1)的相对肿瘤增殖率(14 d，T/C%)分别为 12%，3%，0，16%和 12%，其中JK120303(5 mg·kg-1)组的所有肿瘤均消失，提示K562人慢性髓系白血病皮下瘤治疗模型成功建立，而且所有治疗均有显著的抗K562肿瘤生长作用(P＜0.001)。与达沙替尼(5 mg·kg-1)相比，更低和相同剂量JK120303(2.5，5 mg·kg-1)的抗肿瘤作用更加显著(P均＜0.001)，相对肿瘤增殖率(21 d，T/C%)分别为 36%和 0，提示其优于达沙替尼；JK120304(2.5，5 mg·kg-1)与达沙替尼则无显著性差异。对于结合物 JK120303和 JK120304，5 mg·kg-1治疗组的肿瘤生长曲线均低于2.5 mg·kg-1治疗组，提示抗肿瘤作用存在剂量效应关系。
本实验合成了2个 PEG-达沙替尼结合物，采用小分子原料过量的方法，使得大分子原料反应完全，避免产物中残余难以去除的大分子原料；由于所用的PEG衍生物分别为单臂多头PEG衍生物和多臂 PEG衍生物，它们所带的多个端基成为多个药物连接点，进而连接多个药物分子，但由于这些端基很难完全被药物分子取代完全，因而产物是多种不同取代产物的混合物，即产物JK120303是以三取代产物为主，JK120304是以四取代产物为主，它们都含有少量未取代完全的产物，可以进一步优化反应条件，使得取代尽可能完全。
在NOD/SCID小鼠右侧背部皮下接种K562细胞，建立人慢性髓系白血病异种移植动物皮下模型，除溶剂组小鼠到第 14天因平均肿瘤体积＞2 000 mm3处死外，其余各实验组小鼠体质量呈平稳增长趋势，2个PEG-达沙替尼结合物JK120303(2.5，5 mg·kg-1)和 JK120304(2.5，5 mg·kg-1)对 K562人慢性髓系白血病皮下瘤模型均有显著抑制肿瘤生长的作用，结合物 JK120303(2.5，5 mg·kg-1)的药效优于达沙替尼(5 mg·kg-1)，结合物 JK120304(2.5，5 mg·kg-1)的药效与达沙替尼(5 mg·kg-1)相当，说明模型建立成功，PEG-达沙替尼结合物JK120303药效优于达沙替尼，值得进一步研究。
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Synthesis and Preliminary Pharmacological Efficacy Study of PEG-dasatinib Conjugates
WANG Jinliang, FENG Zewang, ZHAO Xuan
(Tianjin JenKem Technology Co., Ltd., Tianjin 300462, China)
ABSTRACT：OBJECTIVE To synthesis two PEG-dasatinib conjugates (JK120303 and JK120304) and get preliminary antitumor effect of these compounds in the K562 subcutaneous tumor model of human chronic myeloid leukemia. METHODS Dasatinib was derived with valine, then react with mPEG-dipeptide acid and 4arm-PEG-acetic acid to obtain PEG-dasatinib conjugates, K562 cells were inoculated subcutaneously in the right back of NOD/SCID mice to establish human chronic myeloid leukemia xenograft animal subcutaneous model, the curative effect was evaluated according to the relative tumor proliferation rate (T/C%). RESULTS Two PEG-dasatinib conjugates were synthesized, the efficacy of JK120303 (2.5 mg·kg-1and 5 mg·kg-1) was better than that of dasatinib (5 mg·kg-1) and the efficacy of JK120304 (2.5 mg·kg-1and 5 mg·kg-1) was almost the same as that of dasatinib (5 mg·kg-1). CONCLUSION The efficacy of PEG-dasatinib conjugate JK120303 is better than that of dasatinib and worth further study.
KEY WORDS:dasatinib; PEG-dasatinib conjugate; synthesis; pharmacological efficacy
REFERENCES
中图分类号：R914.2
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2017)12-1717-04
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.12.016
引用本文：汪进良, 冯泽旺, 赵宣. 聚乙二醇-达沙替尼结合物的合成及初步药效研究[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(12)：1717-1720.
基金项目：天津市科技计划项目(15PTSYJC00220)
作者简介：汪进良，男，工程师 Tel： (022)25616890 E-mail： jinliangwang@jenkem.com
收稿日期：2017-03-30
(本文责编：曹粤锋)