干燥方式对土鳖虫黄曲霉毒素含量的影响

(1.浙江中医药大学中药饮片有限公司，杭州 311401；2.浙江中医药大学中药炮制技术研究中心，杭州 311401；3.杭州市食品药品检验研究院，杭州 310017)

摘要：目的考察比较干燥方式对土鳖虫黄曲霉毒素含量的影响。方法采购活土鳖虫，沸水烫死后，模拟产地晒干的条件设置一组样品30 ℃烘干，另一组样品设置为较高温度60 ℃快速烘干(每组各制备2批)；依据药典，采用HPLC(荧光检测器)检测比较2组样品的黄曲霉毒素含量。结果30 ℃缓慢烘干者有明显腥臭味，黄曲霉毒素含量严重超标；60 ℃快速烘干者微有腥气，黄曲霉毒素含量合格。与传统日晒品比较，供应商大批量65 ℃烘干12 h者黄曲霉毒素含量合格。结论采用较高温度及时干燥，可以控制土鳖虫黄曲霉毒素含量。

关键词：土鳖虫；干燥方式；高效液相色谱法；荧光检测器；黄曲霉毒素

土鳖虫又名土元、地鳖虫、地乌龟等，为鳖蠊科昆虫地鳖Eupolyphaga SinesisWalker或冀地鳖Steleophaga plancyi(Boleny)的雌虫干燥体。土鳖虫捕捉后，置沸水中烫死，晒干或烘干，药用具有破血逐瘀，续筋接骨的功效，可用于跌打损伤，筋伤骨折，血瘀经闭，产后瘀阻腹痛，瘕瘕痞块等[1]。目前药用土鳖虫已经形成规模养殖，其雌虫体型扁圆肥厚，富含氨基酸、蛋白质、核苷、脂肪酸、生物碱、挥发油、维生素与矿物元素等[2]。

作为动物药，土鳖虫营养丰富，如果加工或储存不当，容易腐败发臭，发霉生菌，之前已经有检测出黄曲霉毒素的报道[3]。而黄曲霉毒素是一类结构类似的二呋喃香豆素类化合物，在1993年即被世界卫生组织(WHO)划定为一类致癌物，是一种毒性极强的真菌毒素，其危害性主要在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡。在被污染的食品及中药产品中主要能检出黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2(以及M1、M2)，其中黄曲霉毒素B1常见，其毒性和致癌性也最强。可以产生黄曲霉毒素的真菌主要是黄曲霉菌和寄生曲霉菌，影响这类腐生菌繁殖及产毒的因素主要是基质、水分、温度、通风条件等[4-6]。

在杭州举办的2016年全国中药材及饮片质量和检验工作研讨会上，上海市食品药品检验所以安全性风险控制为重点，就所承担的土鳖虫项目，检测发现黄曲霉毒素超标情况比较严重(参照中国药典2015年版中僵蚕等动物药的限量标准)，并作为重大问题上报监管部门。从上半年杭州市食品药品检验研究院在市场抽检的土鳖虫饮片看，同样不少样品的黄曲霉毒素含量超标；本公司检测最近批次的土鳖虫样品，黄曲霉毒素含量也有超标现象。水分是霉菌滋生的首要环境因素，因此，本实验从产地加工的干燥方式进行探讨，以控制土鳖虫中的黄曲霉毒素含量。

1 材料和试药

1.1 仪器

Shimadzu LC-20A型高效液相色谱仪、RF-20A荧光检测器、LC solution工作站(日本岛津公司)；Pribolab 2000S高速均质器(青岛普瑞邦生物工程有限公司)；AP-SE-12B型固相萃取装置(美瑞泰克科技有限公司)；AL-204型电子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；KQ-500DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DHG-9240A型恒温干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 试剂耗材

黄曲霉毒素混合标准品(中国食品药品检定研究院，批号：61001-201602，标示浓度黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2分别为1.02，0.43，1.06，0.38 μg·ml-1)；Pribolab免疫亲合柱；甲醇、乙腈为色谱纯，氯化钠为分析纯，水为Mili-Q纯水。

1.3 药材

活土鳖虫购自安徽怀远，经浙江中医药大学中药饮片有限公司钱敏主管中药师鉴定为地鳖Eupolyphaga sinesisWalker。

2 方法与结果

2.1 样品的制备

取约1 kg活土鳖虫置盛放沸水的水盆内烫死，捞起冲洗干净，沥干，立即分别置2台恒温干燥箱内烘干。一部分湿虫30 ℃烘干约96 h作为样品组一(S30℃)，虫体干透，腥臭味明显；一部分湿虫60 ℃烘干约14 h作为样品组二(S60℃)，虫体干透，微有腥气。各组分别制备2批样品。

2.2 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm，5 μm)；柱温：40 ℃；流动相：甲醇-乙腈-水(30∶10∶60)；流速：0.8 mL·min-1；用柱后衍生法检测，光化学衍生器(254 nm)，以荧光检测器检测，激发波长360 nm(或365 nm)，发射波长450 nm。

2.3 溶液准备

2.3.1 混合对照品溶液的制备精密量取黄曲霉毒素混合标准品1.0 ml，置20 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，作为储备液。精密量取储备液1 ml，置25 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备分别取上述样品粉碎过二号筛，精密称定15 g粉末，加入氯化钠3 g，置于匀浆均质器中，精密加入70%甲醇溶液75 ml，高速搅拌2 min(搅拌速度12 000 r·min-1)，离心5 min(离心速度2 500 r·min-1)，精密量取上清液15 ml，置50 ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，量取续滤液20.0 ml，采用固相萃取装置，通过免疫亲合柱，流速每分钟3 ml，用水20 ml洗脱，洗脱液弃去，使空气进入柱子，将水挤出柱子，再用适量甲醇洗脱，收集洗脱液，置2 ml量瓶中，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得[7]。

2.4 系统适用性试验

按“2.2”项下色谱条件，精密吸取“2.3.1”项下混合对照品溶液、供试品溶液各20 μl，注入高效液相色谱仪，结果见图1。由图1分析可知，出峰顺序依次为黄曲霉毒素G2、G1、B2、B1，各目标峰对称性良好，分离度均>1.5。

图1 高效液相色谱图

A-混合对照品；B-样品S30℃；C-样品S60℃；1-黄曲霉毒素G2；2-黄曲霉毒素G1；3-黄曲霉毒素B2；4-黄曲霉毒素B1。

Fig. 1 HPLC chromatograms

A-mixed reference substances; B-test sample S30℃; C-test sample S60℃; 1-aflatoxin G2; 2-aflatoxin G1; 3-aflatoxin B2; 4-aflatoxin B1.

2.5 样品测定

分别精密吸取混合对照品溶液5，10，15，20，25 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线。分别得到黄曲霉毒素B1线性回归方程为Y=2.5× 109X-1 308(r=0.999 8)、黄曲霉毒素B2线性回归方程为Y=5.9×109X-1 205(r=0.999 5)、黄曲霉毒素G1线性回归方程为Y=1.4×109X-627(r=0.999 7)、黄曲霉毒素G2线性回归方程为Y=3.3×109X-469 (r=0.999 8)。可见，黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素G1的进样量在约10~50 pg，黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G2的进样量在约4~20 pg范围内与各自的峰面积呈良好的线性关系。

各样品按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定。每个样品取样2份制备，每份供试品溶液进样2次。精密吸取各供试品溶液20 μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，依据各标准曲线计算出供试品中相当于黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的平均含量。另外，针对安徽怀远某供应商提供的各2批土鳖虫常规晒干样品(S晒)和大批量65 ℃干燥12 h的样品(S65℃)依据同样条件进行了检测。各样品最终计算结果见表1。

表1 样品含量测定结果(n=4)

Tab. 1 Results of sample determination(n=4) μg·kg-1

3 讨论

中国药典2015年版规定19种药材需要检测黄曲霉毒素，其中包含水蛭、地龙、全蝎、蜈蚣、僵蚕5种动物类药材。因此本实验也直接参考药典四部统一的“黄曲霉毒素测定法(通则2351第一法)”进行检测，没有做方法学考察。经比较实验，流动相调整为甲醇-乙腈-水(30∶10∶60)；结果表明，在本色谱条件下，分离度高，峰形更好。

查阅在执行的2005版《安徽省中药炮制规范》，其中土鳖虫“采收与加工”项下描述是“捕获后，置沸水中烫死，干燥”，并没有指定具体干燥方式。经咨询安徽怀远土鳖虫养殖基地，土鳖虫的产地加工一般是沸水烫死后反复晒干，因此模拟晒干的条件设置了一组样品30 ℃烘干，另一组样品设置为较高60 ℃快速烘干(在实验设计时有设置90 ℃干燥组，结果不到10 h即出现焦糊味，而虫体内部还没干透，表明干燥温度不宜过高)。结果，干燥时间分别需要约96 h和14 h。参照药典中19种药材黄曲霉毒素的同一限量规定(每1 000 g含黄曲霉毒素B1不得过5 μg，含黄曲霉毒素G2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2和黄曲霉毒素B1的总量不得过l0 μg)，前者严重超标，后者则是合格的。说明长时间晒干或低温干燥的土鳖虫容易滋生黄曲霉毒素，较高温度及时干燥则可以控制。

为综合比较2种干燥方式对土鳖虫质量的影响，笔者同时按药典标准做了其他检测项目。测得30 ℃和60 ℃烘干的样品水分分别为12.51%和8.83%(药典规定不得过10.0%)；浸出物分别为27.43%和28.21%(药典规定不得少于22.0%)；二者的显微鉴别和薄层鉴别均合格。

实验结果表明，2种干燥方式对土鳖虫的黄曲霉毒素含量的有重大影响。与常规晒干品比较， 65 ℃干燥12 h的土鳖虫样品，质松脆，微有腥气，黄曲霉毒素检测合格(数据见表1)，其他检测项目均合格。

从检测结果看，有明显臭味的样品，黄曲霉毒素含量一般都超标。是否可以作为经验鉴别依据，需要更大样品量的检测数据支持。

土鳖虫采用较高温度及时干燥，置通风干燥处储藏，可以控制其黄曲霉毒素限量。建议国家药典增加土鳖虫的黄曲霉毒素检查项目，以更好地控制其质量，保证用药安全性。

致谢

衷心感谢浙江中医药大学中药饮片有限公司同事章怡、王云飞的支持。

[2] 王鹏程, 吕文纲. 土鳖虫质量控制及药理作用研究进展[J]. 山东中医杂志, 2016, 35(9): 846-848.

[3] ZHANG W, ZOU Y H, ZHUGE L. Content determination of aflatoxins in Eupolyphaga by HPLC [J]. China Pharm(中国药房), 2015, 26(30): 4269-4271.

[4] LAO W Y, LIN S Z. The contamination and Hazards of aflatoxin on food [J]. J Beijing Union Univ(北京联合大学学报), 2011, 25(1): 64-69.

[5] HAO A Y, ZHAO L Y, LIU Y H, et al. HPLC determination of aflatoxin residues in traditional Chinese medicine Yinpian with post column photochemical [J]. Chin J Pharm Anal(药物分析杂志), 2012, 32(12): 2203-2207.

[6] ZHENG R, MAO D, WANG S M, et al. HPLC determination of aflatoxin G2, G1, B2, B1in 6 traditional Chinese drugs [J]. Chin Tradit Pat Med(中成药), 2010, 32(3): 418-421.

(1.Zhejiang Chinese Medicial University Medicial Pieces Co., Ltd., Hangzhou 311401, China; 2.Research Center of TCM Processing technology, Zhejiang Chinese Medicial University, Hangzhou 311401, China; 3.Hangzhou Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310017, China)

ABSTRACT:OBJECTIVETo study and compare the effect of the drying methods on the content of aflatoxins in Euplyphaga Steleophaga.METHODSLiving Euplyphaga Steleophagas were boiled to death. Simulating the dry conditions of producing area, set up a part of samples dried at 30 ℃; another samples dried at 60 ℃ quickly(2 batches per group). According to the pharmacopoeia, the contents of aflatoxins in two group of samples were detected by HPLC(fluorescence detection).RESULTSThe samples drying at 30 ℃ had obvious stench, the content of aflatoxins exceeded standard hardly. The samples drying at 60 ℃ quickly had slightly gamey smell, the content of aflatoxins was qualified. By comparison with traditional naturally dried samples, the samples dried 12 h at 65 ℃ from a supplier, the content of aflatoxins was qualified.CONCLUSIONThe content ofaflatoxins in Euplyphaga Steleophaga can be controlled through timely drying at higher temperature.

引用本文：朱涛, 谌宇, 杜伟锋, 等. 干燥方式对土鳖虫黄曲霉毒素含量的影响[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(11): 1539-1541.

作者简介：朱涛，男，硕士，主管中药师 Tel: (0571)87195915 E-mail: hbzt007@163.com

*通信作者：葛卫红，男，博士，教授 Tel: (0571)87195888 E-mail: Geweihong@hotmail.com