图1 NL-101结构式
Fig. 1 NL-101 structural formula
徐伟良，詹怡飞，杨岚
(杭州民生药物研究院有限公司，杭州 311121)
摘要：目的考察NL-101-羟丙基倍他环糊精包合物的制备方法。方法采用冷冻干燥法制备NL-101-羟丙基倍他环糊精包合物，以NL-101包合率为指标，通过正交试验优化包合条件。结果优化的工艺条件为搅拌速度100 r·min-1，搅拌温度10 ℃，搅拌时间30 min，NL-101：羟丙基倍他环糊精摩尔比为1︰10，按此条件采用冷冻干燥法制备NL-101-羟丙基倍他环糊精包合物，采用X衍射分析和红外光谱法进行确认，表明冷冻干燥后得到了包合物。结论NL-101与羟丙基倍他环糊精通过冷冻干燥法可形成包合物，按此工艺条件，NL-101-羟丙基倍他环糊精包合物的包合率>95%，同时包合物可提高NL-101的溶解度。
关键词：NL-101；羟丙基倍他环糊精；包合；包合率；冷冻干燥
NL-101[1]是既具有DNA损伤又具有组蛋白去乙酰化酶抑制作用的抗恶性肿瘤候选化合物，化学名称是7-[5-[双(氯乙基)-氨基]-1-甲基苯并咪唑-2-基]-N-羟基-庚酰胺。
图1 NL-101结构式
Fig. 1 NL-101 structural formula
NL-101为类白色至淡棕色结晶性粉末，质轻，不溶于水，极微溶于乙醇，微溶于甲醇，易溶于乙酸。遇强酸、强碱、强氧化剂及强光容易降解，在水溶液中不稳定。NL-101分子中的双(氯乙基)氨基基团具有DNA损伤作用，若经口给药，局部高浓度的NL-101能对快速更新的胃肠道上皮细胞产生毒性作用，可能引起严重的胃肠道不良反应，为了保证NL-101用药的安全性和有效性，笔者制备了NL-101羟丙基倍他环糊精包合物[2-6]。因此，本研究考察了羟丙基倍他环糊精对NL-101的包合作用，并且采用红外光谱(infrared spectrum，IR)和X衍射(x-ray diffraction，XRD)等手段对包合物的性质进行研究[7-12]，提高NL-101的顺应性并改善其临床应用。
NL-101对照品(批号：20140121，纯度为98.9%)、NL-101粉末(批号：20140421)来自杭州民生药物研究院有限公司；羟丙基倍他环糊精(西安德立生物化工有限公司，批号：20140323，规格：每袋0.5 kg)，其余试剂均为分析纯。
S23-2恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)；NLG-1型真空冷冻干燥机(中牧南京实业公司)；S220 pH计(梅特勒)；D8 Advance XRD (Bruker)；Tensor 27 FTIR(Bruker)；BT125D电子天平(Sartorius)；1260 VWD液相色谱仪、Eclipse XDB色谱柱(Agilent)。
将0.5 g NL-101溶解于冰醋酸溶液中，16.7 g羟丙基倍他环糊精溶于水中，将NL-101溶液缓慢加入到羟丙基倍他环糊精溶液中进行混合，100 r·min-1搅拌30 min，氢氧化钠调节pH至5.0左右，定容，采用0.22 μm滤器过滤，分装成每瓶3 mL(5 mg·mL-1)，进行冷冻干燥，得到NL-101冻干包合物。
2.2.1 溶液的配制 精密称取NL-101工作对照品约12.5 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇适量溶解后，甲醇稀释至刻度；精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。另取5瓶注射用NL-101，分别加甲醇5 mL使内容物溶解，并转移至100 mL量瓶中；用甲醇多次洗涤容器，洗液并入量瓶内并用甲醇稀释至刻度；精密量取适量，用甲醇定量稀释制成每1 mL中约含NL-101 0.05 mg的溶液，作为供试品溶液。
2.2.2 色谱条件 用十八烷基键合硅胶为填充剂(Kromasil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相0.1%磷酸水溶液-甲醇(72︰28)；检测波长231 nm，流速为0.9 mL·min-1；柱温为30 ℃。取供试品溶液5 μL进样，注入色谱仪，记录色谱图。以外标法计算供试品含量。
2.3.1 溶液的配制 取NL-101对照品31.0 mg，置100 mL量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液；精密量取对照品储备溶液1 mL，置100 mL量瓶中，以四氢呋喃(经分子筛脱水)稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液；另取2瓶注射用NL-101，倾出内容物，混匀，精密称取内容物粉末(约含NL-101 12.5 mg)，转移至100 mL量瓶中，加四氢呋喃(经分子筛脱水)稀释至刻度，振摇4 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
2.3.2 色谱条件 用十八烷基键合硅胶为填充剂(Kromasil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相0.1%磷酸水溶液-甲醇(72︰28)；检测波长231 nm，流速为0.9 mL·min-1；柱温为30 ℃。取供试品溶液5 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。
实验选择搅拌时间、搅拌温度、搅拌速度以及摩尔比进行L9(34)正交试验，实验因素水平表见表1。
表1 实验因素水平表
Tab. 1 The orthogonal experiment factor level table
NL-101-将羟丙基倍他环糊精包合物、NL-101-羟丙基倍他环糊精物理混合物、羟丙基倍他环糊精以及NL-101分别用KBr压片，在400~4 000 cm-1扫描，测定样品的吸收峰。
NL-101-将羟丙基倍他环糊精包合物、NL-101-羟丙基倍他环糊精物理混合物、羟丙基倍他环糊精以及NL-101进行XRD分析，测试条件：40 kV，40 mA，3~40° 2θ。
正交试验结果见表2。极差分析结果显示，各因素对包合率的影响程度依次为D>A>B>C，即摩尔比>搅拌速度>搅拌温度>搅拌时间。对表2的实验结果进行方差分析和F检验，结果见表3。从各因素对包合综合评价影响来看，羟丙基倍他环糊精：NL-101摩尔比值对包合率在所考察的范围内影响显著，而其他3因素影响均不显著。在实验过程中同时也发现摩尔比>1︰5时包合溶液会出现析出现象，说明羟丙基倍他环糊精对于NL-101的溶解度有影响，且用量越大影响越大，但注射级羟丙基倍他环糊精尚未进入中国药典，CFDA的专家也建议在静脉注射剂中要谨慎使用羟丙基倍他环糊精。因此，在进行注射用NL-101处方开发和优化时，控制辅料用量，最多不超过已上市产品的最高用量。伊曲替康注射液(Itraconazole，商品名：斯皮仁诺)是FDA批准上市的采用羟丙基倍他环糊精辅料的药品，且是静脉滴注，与注射用NL-101拟用临床给药方法一致。每200 mg伊曲替康含羟丙基倍他环糊精8 g；刚开始2 d每日2次，以后每日1次，每次200 mg伊曲替康，连续14 d[13]。也就是说，开始2 d每天16 g，以后每日8 g羟丙基倍他环糊精，连续14 d静脉滴注是安全的。根据动物安全性评价试验结果及相关文献[14]，推测NL-101每日临床用量≤200 mg(以70 kg人体体质量推算)，每天1次，连续给药≤2 d。参考伊曲替康注射液的临床应用信息，若每1 mg NL-101用不超过40 mg羟丙基倍他环糊精增溶，即摩尔比为1︰10，在临床试验和临床使用时，该辅料对人体的安全性是有保障的，同时为保证包合溶液的澄清度，选择工艺条件为A3B1C2D3，即搅拌速度为100 r·min-1，搅拌温度为10 ℃，搅拌时间为30 min，NL-101：羟丙基倍他环糊精摩尔比为1︰10。
按上述工艺条件进行3批放大实验，测得包合率均>95.0%，含量均符合要求。结果见表4。
表2 正交试验结果
Tab. 2 The results of orthogonal experiments
表3 各因素对包合率的方差分析结果
Tab. 3 Variance analysis results of various factors on inclusion ratio
表4 3批中试样品包合率和含量测定结果
Tab. 4 Results of Inclusion ratio and content by three batches of samples
NL-101、空白辅料、NL-101-羟丙基倍他环糊精物理混合、研磨混合以及NL-101-羟丙基倍他环糊精包合物的IR光谱见图2。
对比5条曲线发现在1 500 cm-1位置吸收峰变化最明显，在空白对照(2)中无，在API(1)中峰最高，在物理混合1︰5(3)以及研磨混合1︰5(8)中逐渐变小，且在研磨混合物中的强度有所降低，在所有包合物(4~7)的图谱中该位置吸收峰基本消失，表明API和HP-β-CD可能产生了包合反应。
图2 红外光谱图
1-原料红外光谱图；2-空白红外光谱图；3-物理混合红外光谱图；4-包合物(140505F)红外光谱图；5-包合物(140807F)红外光谱图；6-包合物(140814F)红外光谱图；7-包合物(140821F)红外光谱图；8-研磨混合红外光谱图。
Fig. 2 Infra-red spectrogram
1-API-IR; 2-blank-IR; 3-fix by physics of 1︰5-IR; 4-inclusion complex(140505F)-IR; 5-inclusion complex(140807F)-IR; 6-inclusion complex(140814F)-IR; 7-inclusion complex(140821F)-IR; 8-fix by grinding of 1︰5-IR.
NL-101、空白辅料、NL-101-羟丙基倍他环糊精物理及研磨混合以及NL-101-羟丙基倍他环糊精包合物的XRD图谱见图3。
从图3中可见API为晶态，空白对照主要为无定形，但在27~28 ˚之间以及31~32 ˚之间有衍射峰。在包合物(1︰5)和包合物(1︰10)中未见API的衍射峰，但1︰5的研磨混合物中显示在21~22 ˚位置有API的特征峰，1︰5物理混合物中显示在21~22 ˚位置可见API的特征峰，提示在物理混合物和研磨混合物中有晶态API存在。可知包合物中API与羟丙基倍他环糊精进行了包合作用。
图3 X射线衍射图
1-氯化钠衍射图；2-研磨混合1︰5衍射图；3-物理混合1︰5衍射图；4-空白衍射图；5-包合物1︰5衍射图；6-包合物1︰10衍射图；7-原料衍射图。
Fig. 3 X-ray diffraction pattern
1-NaCl-XRD; 2-fix by grinding of 1︰5-XRD; 3-fix by physics of 1︰5-XRD; 4-blank-XRD; 5-inclusion complex of 1︰5-XRD; 6-inclusion complex of 1︰10-XRD; 7-API-XRD.
根据实验结果，NL-101︰羟丙基倍他环糊精摩尔比对包合影响最显著，包合工艺条件如下：搅拌速度为100 r·min-1，搅拌温度为10 ℃，搅拌时间为30 min，NL-101︰羟丙基倍他环糊精摩尔比为1︰10。IR、XRD仪器表征表明，冷冻干燥法制备NL-101-羟丙基倍他环糊精包合物是成功的，该方法可得到溶解性良好的NL-101包合物，为NL-101临床试验提供一种较好的制剂选择。
REFERENCES
[1] 陈瑜, 陈怡. 异羟肟酸衍生物: 中国, CN102186842B [P]. 2014-07-23.
[2] WU J J, SONG T S, CHEN Z H, et al. The advancement of inclusive technology of cyclodextrin [J]. J Xinjiang Norm Univ(Nat Sci Edit)(新疆师范大学学报: 自然科学版), 2005, 24(2): 51-54.
[3] LIAO J Z, PAN Y F. Study on the preparative technique of AM-β-CD inclusion complex [J]. Int Med Health Guid News(国际医药卫生导报), 2004, 10(16): 190-191.
[4] 何仲贵. 环糊精包合技术[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2008: 83-85.
[5] REN X L, OUYANG H Z, WANG G F, et al. Preparation and stability of stilbene glycoside β-cyclodextrin inclusion [J]. Lishizhen Med Mater Med Res(时珍国医国药), 2011, 22(1): 195-197.
[6] HU H X, WANG X S. Determination of neogambogic acid in inclusion complex freeze-dried powder of neogambogic acid with hydroxypropyl-β-cyclodextrin by high performance liquid chromatography [J]. J Anhui Tradit Chin Med Coll(安徽中医学院学报), 2011, 30(3): 55-57.
[7] ZHAO X X, GAO L, LIANG Y Y, et al. Preparation and characterization of butylphthalide-sulfobutyl-β-cyclodextrin inclusion complex [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2016, 33(6): 762-767.
[8] ZENG J, REN Y, ZHANG Z H, et al. Preparation and characterization of the edaravone and cyclodextrin inclusion complex [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2010, 27(9): 814-817.
[9] WAN G W, XIE H, MAO C Q, et al. Difference in inclusion behavior ofβ-cyclodextrin and hydroxypropyl-β-cyclodextrin with menthol [J]. China J Chin Mater Med(中国中药杂志), 2016, 41(18): 3336-3341.
[10] ZHANG L, REN Y. Study on the inclusion of insulin and β-cyclodextrin [J]. Chin Aca Med Mag Organ(中国医学生物技术应用杂志), 2003(3): 53-56.
[11] YANG X H, REN Y. The characteristics of nimodipine/SBE7-β-CD inclusion complex [J]. Chin J Mod Appl Pharm(中国现代应用药学), 2003, 20(5): 380-383.
[12] SHEN W, ZHANG G H, GUO N, et al. Study on the inclusion compound of avermectin by infrared spectroscopy [J]. Spectrosc Spect Anal(光谱学与光谱分析), 2014, 34(5): 1201-1205.
[13] 西安扬森. 伊曲康唑注射液说明书[K]. 2007.
[14] GOHEER M A. Pharmcology/toxiclogy review and evaluation: Treanda [M/OL]. FDA, 2007. https: //www.accessdata.fda. gov/drugsatfda_docs/nda/2008/22249s000_ pharmR.Pdf.
(本文责编：李艳芳)
Study on the Preparation of NL-101-hydroxypropylbetadex Inclusion Complex and its Characteristic
XU Weiliang, ZHAN Yifei, YANG Lan
(Hangzhou Minsheng Institutes for Pharma Research Co., Ltd., Hangzhou 311121, China)
ABSTRACT:OBJECTIVETo study the preparation of NL-101-hydroxypropyl betacyclodextrin inclusion complex.METHODSThe NL-101-hydroxypropylbetadex inclusion complex was prepared by freeze drying method and was optimized with inclusion ratio as index by orthogonal experiment.RESULTSThe optimized conditions were 100 r·min-1of stirring speed, 10 ℃ of stirring temperature, 30 min of stirring time, 1︰10 of ratio of NL-101:hydroxypropyl betacyclodextrin confirmed by X-ray diffraction method and infrared spectroscopy.CONCLUSIONNL-101-hydroxypropylbetadex inclusion complex can be effectively prepared with freeze drying method. And the inclusion with greater than 95% of the inclusion ratio is prepared. The solubility of NL-101 is increased when the durg was included by hydroxypropyl betacyclodextrin.
KEY WORDS:NL-101; NL-101-hydroxypropylbetadex; inclusion complex; inclusion ratio; freeze drying
中图分类号：R943
文献标志码：B
文章编号：1007-7693(2017)11-1568-04
DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.11.015
引用本文：徐伟良，詹怡飞，杨岚. NL-101-羟丙基倍他环糊精包合物的制备及其特性研究[J]. 中国现代应用药学, 2017, 34(11): 1568-1571.
作者简介：徐伟良，男，工程师 Tel: 13738054869 E-mail: xwl@mspharm.com
收稿日期：2016-11-23