HPLC同时测定通脉颗粒中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、阿魏酸和葛根素的含量

鲁晓光1，陈星1，李军2，孙云峰2

(1.河南省南阳市食品药品检验所，河南 南阳473061；2.辽宁中医药大学基础医学院，沈阳 110847)

摘要：目的 建立通脉颗粒中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、阿魏酸和葛根素的HPLC测定方法。方法 采用Welch Ultimate XD-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈-0.1%三氟乙酸为流动相，梯度洗脱，双波长检测(282，305 nm)，柱温35 ℃，流速1.0 mL·min-1。结果 丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛、葛根素和阿魏酸的线性范围分别为3.117～62.33 μg·mL-1(r=0.998 7)，4.044～80.88 μg·mL-1(r=0.9985)，1.280～25.60 μg·mL-1(r=0.997 9)，7.964～159.3 μg·mL-1(r=0.992 8)，1.980～39.60 μg·mL-1(r=0.999 1)；平均回收率分别为 101.6%(RSD=1.62%)，99.7%(RSD=1.76%)，97.4%(RSD=1.19%)，99.9%(RSD=1.52%)，102.2%(RSD=1.56%)。结论 该方法操作简便、快速，结果准确，可用于通脉颗粒的质量控制。

关键词：丹参素；原儿茶醛；丹酚酸B；阿魏酸；葛根素；通脉颗粒；高效液相色谱法

通脉颗粒系临床常用药，具有活血通脉之功效，用于缺血性心脑血管疾病、动脉硬化、脑血栓、脑缺血、冠心病、心绞痛等病症。处方由丹参[1]、川芎、葛根3味药材组成。其中丹参主要含有水溶性的丹参酚酸类和脂溶性的二萜类成分。近年来研究表明，丹参水溶性成分原儿茶醛、丹参素、丹酚酸 B的扩张心脑血管作用较二萜醌类的丹参酮更强，是抗心肌缺血的主要成分。川芎含有生物碱类、酚酸类和苯酞类成分，其酚酸类成分阿魏酸能增加冠脉血流量，保护缺血心肌，有利于改善心肌对氧的供需失衡，还具有抗血小板聚集作用。葛根含有异黄酮类成分葛根素，具有活血化瘀、改善微循环、扩张冠状动脉和脑血管、降低心肌耗氧量等作用。通脉颗粒在国内有50余家企业生产,质量标准有20余个，但是其仅对单一成分的含量进行测定,而目前关于通脉颗粒的报道[2-12]也未见同时对制剂处方中所有药材中主要有效成分丹参素、原儿茶醛、葛根素、阿魏酸、丹参酸 B进行含量测定方法的报道。为了更简便、全面地对通脉颗粒进行质量评价，本实验建立了 HPLC含量测定方法，为更有效地进行通脉颗粒质量评价提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695-2996高效色谱系统(美国 Waters公司，包括四元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器)；SB3200超声波清洗器(美国必能信超声有限公司)；XS205分析天平(瑞士梅特勒-托利多集团)。

1.2 试药与试剂

丹参素钠(批号：110855-200508，纯度：99.5%)、原儿茶醛(批号：110810-201007，纯度：98.2%)、丹酚酸B(批号：111562-201615，纯度：96.2%)、阿魏酸(批号：110773-201614，纯度：99.1%)和葛根素(批号：110752-201313，纯度：95.5%)均购自中国食品药品检定研究院；通脉颗粒(南阳市食品药品检验所委托仲景宛西制药股份有限公司制备，批号：160301，160302，160303，160401，160402，160403，规格：每袋10 g)；乙腈(色谱纯，美国天地有限公司)；甲醇、三氟乙酸均为分析纯(国药集团化学试剂北京有限公司)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Welch Ultimate XD-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%三氟乙酸(B)，梯度洗脱(0～20 min，5%A；20～30 min，5%→9%A；30～60 min，9%A；60～80 min，9%→22%A；80～110 min，22%A)；体积流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：282 nm(丹参素、原儿茶醛)，305 nm(丹酚酸B、阿魏酸、葛根素)；进样量：10 μL。

2.2 混合对照品溶液

精密称取丹参素钠(按分子量转换成丹参素)、丹酚酸 B、原儿茶醛、阿魏酸和葛根素对照品16.98，10.51，13.05，9.99，20.85 mg，分别置 50，50，100，50，50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储存液，再分别精密吸取10，20，10，10，20 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，即制成浓度分别为 31.166 7，40.442 5，12.80 2，19.800 2 和 79.647 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液

取通脉颗粒，研细，精密称取0.5 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液25 mL，密塞，称定质量，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)3 min，放冷，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性样品溶液

按通脉颗粒处方制得分别不含丹参、葛根和川芎的样品，按“2.3”项下方法分别制备成不含丹参的阴性样品溶液、不含葛根的阴性样品溶液和不含川芎的阴性样品溶液。

2.5 专属性试验

取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各适量，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，见图1，结果丹参素、原儿茶醛、葛根素、阿魏酸和丹酚酸 B的色谱峰保留时间分别为11.9，22.4，51.3，70.8和95.2 min左右，理论板数均＞5 000，各成分互不干扰，阴性样品溶液1～3对测定无干扰。

2.6 线性关系考察

按“2.1”项下色谱条件进样分析，设定混合对照品溶液进样体积分别为 1.0，3.0，5.0，7.5，10.0，15.0和20.0 μL。以组分浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归。结果丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛、葛根素和阿魏酸的线性回归方程分别为Y=7 280.5X-7 025.8(r=0.998 7)，Y=10 995.4X-116 64.1(r=0.998 5)，Y=44 143.1X-28 312.6(r=0.997 9)，Y=17 916.6X-82 458.8(r=0.982 8)；Y=43 293.4X-30 741.5(r=0.999 1)；分别在 3.117～62.33，4.044～80.88，1.280～25.60 ，7.964～159.3，1.980～39.60 µg·mL-1内线性关系良好。

2.7 仪器精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样6次，测得丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛、葛根素和阿魏酸的峰面积及其保留时间，计算RSD，其峰面积RSD分别为1.48%，1.77%，1.14%，0.89%，1.49%，保留时间 RSD分别为0.72%，0.48%，0.36%，0.51%，0.63%,结果表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验

精密吸取供试品溶液(批号：160301)，分别按“2.1”项下色谱条件，在 0，2，4，6，8，12，24 h重复进样，记录丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛、葛根素和阿魏酸的峰面积，测得其 RSD分别为0.97%，1.81%，1.23%，0.52%和 1.26%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

图1 高效液相色谱图
A-混合对照品；B-样品；C-缺丹参的阴性样品；D-缺葛根的阴性样品；E-缺川芎的阴性样品；1-丹参素；2-原儿茶醛；3-葛根素；4-阿魏酸；5-丹酚酸B。
Fig. 1 HPLC chromatograms
A-mixture reference substance; B-sample; C-negative sample withoutSalvia miltiorrhiza; D-negative sample without Puerariae Radix; E-negative sample withoutLigusticum chuanxiongHort; 1-tanshinol; 2-protocatechualdehyde; 3-puerarin; 4-ferulic acid; 5-salvianolic acid B.

2.9 重复性试验

取同一批号样品(批号：160301)，按“2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测得其峰面积RSD分别为1.73%，1.77%，1.54%，0.89%和1.12%，结果表明本方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验

取已知含量的样品(批号：160301)6份，每份约0.25 g。置具塞锥形瓶中，每2份样品中分别精密加入混有一定量的混合对照品溶液(精密量取丹参素、丹酚酸B、原儿茶醛、葛根素和阿魏酸对照品储存溶液各5，10，2，10，3 mL，置50，100，200 mL量瓶中，加入甲醇溶液稀释至刻度，摇匀)25 mL，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条分别测定。计算平均回收率，结果见表1。

表1 加样回收率实验结果(n=6)
Tab. 1 Results of recovery test(n=6)

组分样品含量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%0.282 4 0.155 8 0.433 2 0.988 6丹参素0.294 9 0.155 8 0.453 9 1.007 1 0.292 3 0.233 8 0.540 2 1.026 8 0.295 7 0.233 8 0.547 5 1.034 0 0.285 5 0.311 7 0.606 5 1.015 7 0.280 1 0.311 7 0.606 2 1.024 3 101.6 1.62 0.614 0 0.252 8 0.877 5 1.012 3丹酚酸B 0.641 0 0.252 8 0.869 5 0.972 8 0.635 5 0.505 5 1.138 3 0.997 6 0.642 8 0.505 5 1.172 7 1.021 2 0.620 8 0.758 3 1.367 2 0.991 4 0.609 0 0.758 3 1.350 3 0.987 6 99.7 1.76 0.049 1 0.064 1 0.110 4 0.975 3原儿茶醛0.051 3 0.064 1 0.113 2 0.980 9 0.050 8 0.096 1 0.145 6 0.991 2 0.051 4 0.096 1 0.142 6 0.966 8 0.049 7 0.128 2 0.170 4 0.957 8 0.048 7 0.128 2 0.171 8 0.971 2 97.4 1.19 1.215 7 0.497 8 1.696 5 0.990 1葛根素1.269 2 0.497 8 1.738 2 0.983 7 1.258 3 0.995 6 2.276 6 1.010 1 1.272 6 0.995 6 2.272 3 1.001 8 1.229 1 1.493 4 2.782 1 1.021 9 1.205 8 1.493 4 2.660 0 0.985 5 99.9 1.52 0.093 3 0.099 0 0.194 8 1.013 0阿魏酸0.097 4 0.099 0 0.196 3 0.999 5 0.096 6 0.148 5 0.252 1 1.028 6 0.097 7 0.148 5 0.250 6 1.017 9 0.094 4 0.198 0 0.299 6 1.024 6 0.092 6 0.198 0 0.304 1 1.046 5 102.2 1.56

2.11 样品含量测定

精密称取6批样品(批号：160301，160302，160303，160401，160402，160403)，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样。照外标法(峰面积)计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)
Tab. 2 Results of content determination of samples(n=3)

批次 含量/mg·g-1丹参素 丹酚酸B 原儿茶醛 葛根素 阿魏酸160301 1.15 2.50 0.20 4.95 0.38 160302 1.24 2.77 0.22 4.60 0.39 160303 1.02 2.35 0.18 4.73 0.38 160401 1.45 2.86 0.24 4.89 0.40 160402 1.28 2.61 0.25 4.85 0.38 160403 1.37 2.44 0.27 4.79 0.34

3 讨论

通过DAD在190～400 nm全波长扫描得知，丹参素最大吸收峰波长为282 nm，原儿茶醛最大吸收峰波长为207，230，282，310 nm，葛根素最大吸收峰波长为249，305 nm，阿魏酸最大吸收峰波长为221，236，322 nm，丹酚酸B最大吸收峰波长为286 nm，经综合考虑：阿魏酸301～307 nm波长有比较好的吸收值，而丹酚酸 B在 303～308 nm波长也有比较好的吸收值，所以选择丹参素、原儿茶醛紫外检测波长为282 nm，丹酚酸B、阿魏酸、葛根素紫外检测波长为305 nm。

本实验经查询相关资料，选定甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇6种溶液，超声和回流2种方式，10，20，30，40，50 min 5个时间段，实验结果显示，采用 70%甲醇溶液提取各组分含量相对较高，超声比回流提取各组分含量相对较高，提取时间在30 min后无明显增加。综上考虑，选择70%甲醇溶液超声30 min作为供试品溶液的制备方法。

分别考察了甲醇-1%冰乙酸梯度洗脱系统、乙腈-1%冰乙酸梯度洗脱系统、乙腈-0.02%磷酸梯度洗脱系统、乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统、乙腈-0.1%三氟乙酸梯度洗脱系统，实验结果显示，乙腈-0.1%三氟乙酸梯度洗脱系统分离效果最佳，遂选择此流动相。

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Simultaneous Determiation of Tanshinol, Protocatechualdehyde, Salvianolic Acid B, Ferulic Acid and Puerarin in Tongmai Particles by HPLC

LU Xiaoguang1,CHEN Xing1, LI Jun2, SUN Yunfeng2
(1.Nanyang Institute for Food and Drug Control, Nanyang 473061, China;2.Basic Medical College of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110847, China)

ABSTRACT:OBJECTIVE To estahlish an HPLC method for the simultaneous determination of tanshinol,protocatechualdehyde, salvianolic acid B, ferulic acid and puerarin in Tongmai particle by HPLC. METHODS The Welch Ultimate XD-C18colunm(4.6 mm×250 mm, 5 μm) was used. The mobile phase was acetonitrile-0.1% trifluoroacetic acid in gradient mode. The flow rate was 1.0 mL·min-1with UV detection wavelength at 282 nm and 305 nm. The column temperature was maintained at 35 ℃. RESULTS The linear ranges of tanshinol, salvianolic acid B, protocatechualdehyde, puerarin and ferulic acid were in the range of 3.117-62.33 μg·mL-1(r=0.998 7), 4.044-80.88 μg·mL-1(r=0.998 5), 1.280-25.60 μg·mL-1(r=0.997 9), 7.964-159.3 μg·mL-1(r=0.992 8), 1.980-39.60 μg·mL-1(r=0.999 1) with average recoveries of 101.6%(RSD=1.62%), 99.7%(RSD=1.76%), 97.4%(RSD=1.19%), 99.9%(RSD=1.52%), 102.2%(RSD=1.56%), respectively. CONCLUSION This method is simple, fast and accurate, which is suitable for quality control of Tongmai particles.

KEY WORDS:tanshinol; protocatechualdehyde; salvianolic acid B; ferulic acid; puerarin; Tongmai particles; HPLC

REFERENCES

中图分类号：R917.101

文献标志码：B

文章编号：1007-7693(2017)10-1373-04

DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.10.003

引用本文：鲁晓光, 陈星, 李军, 等. HPLC同时测定通脉颗粒中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、阿魏酸和葛根素的含量[J].中国现代应用药学, 2017, 34(10): 1373-1376.

基金项目：中国博士后科学基金面上资助项目(2015M570257)

作者简介：鲁晓光，男，主管药师 Tel: 13633997151 E-mail: 87931473@qq.com

收稿日期：2017-05-08

(本文责编：曹粤锋)