UPLC-MS/MS测定减肥食品中8种非法添加化学成分

裘一婧1，曹王丽2，方玲2,3*

(1.杭州市食品药品检验研究院，杭州 310052；2.浙江康恩贝制药股份有限公司，杭州 310052；3.浙江中药制药技术重点实验室，杭州 310052)

摘要：目的 建立一种简便有效检测减肥食品中非法添加化学成分的UPLC-MS/MS检测方法。方法 采用UPLC-MS/MS法，以Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)色谱柱分离，串联四级杆质谱仪检测，多反应监测模式进行定性定量分析，以流动相A(0.02 mol·L-1乙酸铵水溶液)-B(甲醇)进行梯度洗脱；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1，进样量2 μL。样品以甲醇为溶剂超声提取，快速定性定量检测非法添加在减肥食品中的麻黄碱、咖啡因、呋塞米、芬氟拉明、酚酞、N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明、西布曲明8种化学成分。结果 8种减肥类化学成分质谱检测的线性范围宽，相关性R2≥0.995；方法检测限为 0.042～0.175 μg·mL-1，定量限为 0.126～0.525 μg·mL-1，方法精密度 RSD(n=6)为1.7%～4.7%；3个浓度水平的平均回收率为 90.3%～105.1%。结论 本方法专属性强、操作简单、方便快捷，可作为食品中非法添加减肥类化学成分的有效检测方法。

关键词：UPLC-MS/MS；减肥食品；化学成分；非法添加

目前，以瘦为美的审美观成为社会的主流，而肥胖带来的健康问题也日益凸显，故人们对减肥产品的需求也越来越大。一些企业为增强减肥效果，在保健食品和中成药中非法添加化学药物，对消费者的身体和经济均造成严重危害[1]。有关部门积极应对，制定相关的实验方法，例如国家食品药品监督管理局颁布的药品检验补充检验方法和检验项目批准件2012005、食药监办许[2010]114等对中成药和保健食品进行监管，而消费者日常食用的减肥食品中是否存在非法添加化学药物未见报道。麻黄碱、咖啡因、呋塞米、芬氟拉明、酚酞、N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明、西布曲明，上述 8种化学成分为非法添加的重灾区，长期食用会造成成瘾性、肝肾功能损坏等严重不良反应[2-5]。

目前用于减肥类保健食品非法添加的筛查方法主要有 HPLC、HPLC-MS、GC-MS、薄层色谱法等[6-9]。国家食品药品监督管理局食药监办许[2010]114号文附件 2“减肥类保健食品违法添加药物的检测方法”，适用于减肥类中成药及保健食品中非法添加 5种化学药品的筛查和验证，但该方法操作时间长[10-12]。

本研究针对减肥食品中非法添加减肥类化学成分检测方法的缺失和标准落后的情况，初步建立快速检验和定性定量分析方法，采用UPLC-MS/MS检测食品中添加麻黄碱、咖啡因、呋塞米、芬氟拉明、酚酞、N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明、西布曲明 8种化学成分，为打击非法添加、药品监管及规范保健食品市场提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器

超高效液相色谱-串联四级杆质谱联用仪G6410BA、电喷雾离子化源(ESI)、Mass Hunter Workstation Software Qualitative Analysis Version B.01.03、Mass Hunter Workstation Software Quatitative Analysis Version B.01.04数据处理系统(美国 Agilent公司)；MILLI-Q 纯水-超纯水系统(美国 Millipore仪器公司)；8510 J-DTH超声清洗仪(YAMATO)

1.2 样品与试剂

本实验测定12批次减肥类食品，均为杭州市食品药品监督管理局抽样所得，具体信息见表1。

表1 减肥类食品抽样情况
Tab. 1 Sampling of diet foods

序号 样品名称 批号1 纤体梅 87261081 2 纤姿梅 1261001388 3 肠清梅 3617208 4 金广元修身梅 103 5 妙女郎酵素梅 20130813 6 酵素青梅 220003 7 台湾西梅排毒减肥果 RT1013 8 果然神奇瘦身咖啡 20150408 9 酵素枣 20150403 10 纤梅 -11 纤果酵素饮 061210 12 减肥饼干 240453

麻黄碱(批号：171241-201007，纯度：99.7%)、咖啡因(批号：171215-2010，纯度：99.9%)、呋塞米(批号：100544-2001102，纯度：99.7%)、芬氟拉明(批号：0073-0002，纯度：100%)、酚酞(批号：100091-199601，纯度：100%)、单去甲基西布曲明(批号：520002-201301，纯度：98.8%)、双去甲基西布曲明(批号：520001-201301，纯度：98.9%)、西布曲明(批号：100624-200401，纯度：100%)对照品均购自中国食品药品检定研究院；实验用水为超纯水，其他试剂均为色谱纯。

2 方法

2.1 UPLC色谱条件

色谱柱：Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)；流动相：0.02 mol·L-1乙酸铵水溶液(A)-甲醇(B)，梯度如下：0 min，70%A，0～4 min，70%A→10%A，4～11 min，10%A；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1，进样量为 2 μL。

2.2 质谱条件

毛细管电压：3.0 kV；脱溶剂气(N2)流量为12 L·min-1；喷雾气流量为40 psi；脱溶剂气温度为 325 ℃；采用多反应监测(multiple-reaction monitoring，MRM)模式检测；离子模式为ESI+/ESI-。8种减肥类化学成分的其他质谱分析参数见表2。8种减肥类化学成分MRM色谱图见图1。

表2 8种减肥类化学成分的质谱分析参数
Tab. 2 The MS parameters for 8 slimming drugs

注：*为定量离子对。
Note：* was the ion pair for quantitation.

组分 离子模式 监测离子对 锥孔电压/v 碰撞能量/v麻黄碱 ESI+166＞148*166＞132 25 25 20 329＞205* 25 12 12芬氟拉明 ESI+232＞186.9*咖啡因 ESI+195＞138* 25 15呋塞米 ESI-329＞285 232＞159.1 25 10 15酚酞 ESI+319＞225*319＞297 25 30 25 N-单去甲基西布曲明 ESI+266＞153*266＞125 25 10 15 N,N-双去甲基西布曲明 ESI+252＞139 252＞125* 25 10 10西布曲明 ESI+280＞179 280＞139* 25 10 15

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液 分别精密称取麻黄碱、咖啡因、呋塞米、西布曲明对照品20 mg，芬氟拉明、酚酞、N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明对照品10 mg，分别置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇超声溶解，稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述溶液1.0 mL置于10 mL量瓶中，加入甲醇，配制成含麻黄碱、咖啡因、呋塞米、西布曲明的浓度为0.2 mg·mL-1，含芬氟拉明、酚酞、N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明对照品浓度为0.1 mg·mL-1的对照品储备溶液。分别精密吸取上述对照品储备溶液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL分别置于50 mL量瓶中，加流动相稀释定容，分别作为对照品系列溶液(1)～(6)。

2.3.2 供试品溶液 液体、固体饮料类食品：取供试品10 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇约20 mL，加流动相稀释至刻度，用0.2 μm滤膜过滤，即得。

话梅蜜饯类食品：取供试样品 1粒，剪碎后精密称定，置于50 mL量瓶中，加甲醇约20 mL，超声提取30 min(100 W，56 kHz)，冷却至室温，加流动相稀释至刻度，用0.2 μm滤膜过滤，即得。

饼干糕点类食品：取供试样品 10 g，研碎后精密称定，置于50 mL量瓶中，加甲醇约20 mL，超声提取30 min(100 W，56 kHz)，冷却至室温，加流动相稀释至刻度，用0.2 μm滤膜过滤，即得。

样品中检出添加减肥类化学成分的 MRM 色谱图见图2。

3 结果

3.1 线性关系、检测限和定量限

取已制备的对照品系列溶液，分别进样2 μL，以定量监测离子对的离子流中谱峰峰面积(Y)为纵坐标，对照品浓度(X，μg·mL-1)为横坐标进行线性关系考察，结果表明 8种化学药在各自的质量浓度范围内与色谱峰峰面积均呈良好线性关系，均在0.995～0.999，结果见表3。

取12号样品(检测结果为阴性)10 g，加入适当稀释的混合对照品溶液，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，以信噪比为3时8种减肥成分的检测限和信噪比为 10时的定量限，LOD为0.042～0.175 μg·mL-1，LOQ 为 0.126～0.525 μg·mL-1，表明方法具有较高的灵敏度，完全能满足非法添加化学药的检测要求，结果见表3。

3.2 重复性试验

取对照品系列溶液(3)连续进样6次，RSD分别为4.7%，4.2%，3.0%，1.7%，2.1%，3.0%，3.8%，2.7%。表明该方法重复性较好，结果见表3。

3.3 加样回收率试验

取12号样品(阴性)，每份称取样品10 g，分别加入适量的对照品储备溶液0.2，0.6，1 mL，平行 3份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，检测含量，计算回收率，结果显示 8种化学成分的加样回收率均在90.3%～105.1%，结果见表4。

3.4 日间精密度

以对照品系列溶液(3) 3 d重复进样，每天重复进样3次，峰面积的RSD作为日间精密度，日间精密度RSD控制在1.7%～4.5%。表明方法精密度良好，结果见表4。

3.5 样品定性检测

本方法采用“MRM”模式检测，如表1所示质谱分析方法，每一成分都有多个(咖啡因有1个，其余成分2个)检测通道，每一通道对应一个监测离子对。样品检测时，若某一成分对应的多个通道中均出现与对照品保留时间一致的谱峰，并且这几个子离子的相对丰度与对照品一致，则可判定样品中检出该成分。定性结果见表5，表中各成分的丰度数据均符合欧盟 2002/657/EC法规关于定性判断时相对离子丰度得允许偏差范围，可判断这些子离子的相对丰度一致。按上述法规的分值法(质谱分析方法鉴定点数)计算，上述定性过程已达到4分，＞3分的要求，可判断样品1～9号中均检出酚酞，10号检出咖啡因减肥成分，样品11、12号为阴性样品，其余6种减肥成分均未检出。

表3 8种减肥非法添加成分的线性关系、检测限、定量限和重复性
Tab. 3 Linear regression results, LOD, LOQ and reproducibility of 8 slimming drugs

组分 线性范围/μg·mL-1线性方程 相关性(R2) 检测限(LOD，μg·mL-1)定量限(LOQ，μg·mL-1)重复性RSD(n=6)/%麻黄碱 0.428～4.28Y=2 071.9X-151.35 0.996 0.171 0.514 4.7咖啡因 0.413～4.13Y=11 204X-714.79 0.998 0.165 0.496 4.2呋塞米 0.437～4.37Y=12 473X+745.21 0.995 0.175 0.525 3.0芬氟拉明 0.234～2.34Y=47 841X-1358.6 0.998 0.058 0.174 1.7酚酞 0.232～2.32Y=234 865X-34452 0.997 0.093 0.278 2.1 N-单去甲基西布曲明 0.210～2.10Y=59 157X-2783.9 0.997 0.042 0.126 3.0 N,N-双去甲基西布曲明 0.207～2.07Y=24 191X-312.07 0.999 0.083 0.249 3.8西布曲明 0.401～4.01Y=6 848.1X+ 357.72 0.999 0.160 0.481 2.7

图1 8种减肥类化学成分MRM色谱图
Fig. 1 MRM of 8 chemical drugs used for slimming

图2 样品中检出化学成分的MRM色谱图
注：以样品1和样品10的MRM色谱图为代表。
Fig. 2 MRM chromatogram of the chemical composition detected in samples
Note: The sample is represented by MRM chromatogram of sample 1 and sample 10.

表4 回收率与日间精密度(n=3)
Tab. 4 The recoveries and inter-day precision(n=3)

组分 添加浓度水平/μg·mL-1平均回收率/%日间精密度/%0.856 103.7麻黄碱2.568 94.2 4.28 98.8 3.7 0.826 93.1咖啡因2.478 95.3 4.13 95.4 4.1 0.874 4 95.7呋塞米2.623 2 97.2 4.372 99.2 3.9 0.467 2 95.1芬氟拉明1.401 6 96.8 2.336 97.4 2.1 0.464 98.2酚酞1.392 101.1 2.32 97.9 2.6 0.420 8 95.7 N-单去甲基西布曲明1.262 4 97.2 2.104 97.8 3.8 0.414 4 105.1 N,N-双去甲基西布曲明1.243 2 90.3 2.072 95.4 4.5 0.801 6 96.2西布曲明2.404 8 97.1 4.008 100.9 1.7

表5 8种减肥成分定性分析
Tab. 5 The qualitative analysis of 8 slimming drugs

注：*为定量离子对。
Note：* was the ion pair for quantitation.

样品中各成分子离子丰度/%组分 监测离子对/m·z-1对照品各子离子丰度/%1～9号 10～11号酚酞 319＞225*319＞297 80.9 19.8 80.4～81.2 19.2～20.2 /咖啡因 195＞138* 21.8 78.6 / 20.5～22.3 78.0～79.5

3.6 样品定量检测

根据定量监测离子对的离子流图中谱峰峰面积外标法计算样品中减肥化学成分的含量。定量结果见表6。

4 讨论

本实验基于UPLC-MS/MS的超高分辨能力、超高分析速度及质谱提供的结构信息，开发减肥食品中常见非法添加盐酸麻黄碱、咖啡因、呋塞米、芬氟拉明、酚酞、N-单去甲基西布曲明、N,N-双去甲基西布曲明和西布曲明 8种化学成分的定性定量检测方法。通过MRM扫描模式，针对每个化合物选取2个特征碎片离子(咖啡因一个碎片离子)作为定性依据，同时选择其中响应较高的反应离子对作为定量离子对，从而实现对上述 8种化学添加药物的定性定量分析，并将上述方法应用于12批减肥食品的非法添加检测工作，结果表明，12批减肥类保健食品9类添加了酚酞，1类添加了咖啡因。

表6 样品中8种减肥化学成分的分析结果
Tab. 6 Detection results of 8 slimming drugs in samples mg·g-1

序号 样品名称 批号 酚酞 咖啡因 其余6种减肥成分1 纤体梅 87261081 0.026 未检出 未检出2 纤姿梅 1261001388 11.017 未检出 未检出3 肠清梅 3617208 12.341 未检出 未检出4 金广元修身梅 103 0.014 未检出 未检出5 妙女郎酵素梅 20130813 12.977 未检出 未检出6 酵素青梅 220003 10.765 未检出 未检出7 台湾西梅排毒减肥果 RT1013 0.312 未检出 未检出8 果然神奇瘦身咖啡 20150408 7.031 - 未检出9 酵素枣 20150403 0.311 未检出 未检出10 纤梅 - 未检出 0.180 未检出11 纤果酵素饮 061210 未检出 未检出 未检出12 减肥饼干 240453 未检出 未检出 未检出

实验采用UPLC作为分离手段，分析速度快，只需11 min即可完成检测，在实际快检及处理药品绿色通道检验时，效果良好。采用串联四极杆的MRM模式检测，可同时进行定性定量分析，利用化学成分的各母离子、子离子信息，已符合定性检测的判定要求，可作为减肥食品中质量与安全用药的控制方法不仅可用于检测胶囊剂和颗粒剂样品中添加的化学减肥药，也可用于其他剂型中成药和保健食品的快速筛查。本法集快速初筛技术、验证技术和准确定量于一体，既节省了大量的人力物力，又极大地提高了非标检测工作的效率，为打击非法添加，为药品监管及规范保健食品市场提供技术支撑，具有重要的社会意义。

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Determination of 8 Illegal Added Chemical Composition in the Slimming Health Food by UPLC-MS/MS

QIU Yijing1, CAO Wangli2, FANG Ling2,3*
(1.Hangzhou Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310052, China;2.Zhejiang CONBA Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou 310052, China; 3.Zhejiang Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Technology, Hangzhou 310052, China)

ABSTRACT:OBJECTIVE To develop a UPLC-MS/MS method to determine illegal chemical composition added into the slimming health food. METHODS The analysis was performed by a UPLC-MS/MS system with Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm, 1.8 μm) column, with 0.02 mol·L-1acetic acid (A)-methanol (B) as mobile phase by gradient elution at a flow rate of 0.3 mL·min-1, and the column temperature was 40 ℃. Multiple-reaction monitoring (MRM) was performed to identify and quantify 8 chemical drugs, including ephedrine hydrochloride, caffeine, furosemide, fenfluramine, phenolphthalein, N-single demethylated sibutramine,N,N-didesmethylsibutramine and sibutramine. RESULTS A good resolution of 8 kinds of chemical drugs were obtained under this UPLC-MS/MS condition. Eight linear calibration curves were obtained withR2≥0.996 7. The limits of qualitation and quantitation were in the range of 0.042-0.175 μg·mL-1and 0.126-0.525 μg·mL-1. The precision of the method were showed by RSD (n=6) ranged from 1.7% to 4.7%. The average recoveries (n=6) were in the range of 90.3% to 105.1% at three concentrations levels. CONCLUSION The method is simple, accurate, and highly sensitive, which can be used for the determination of illegally added chemical drugs in slimming health foods.

KEY WORDS:UPLC-MS/MS; slimming health food; chemical composition; illegally added

REFERENCES

中图分类号：R917.101

文献标志码：B

文章编号：1007-7693(2017)10-1441-06

DOI:10.13748/j.cnki.issn1007-7693.2017.10.017

引用本文：裘一婧, 曹王丽, 方玲. UPLC-MS/MS法测定减肥食品中8种非法添加化学成分[J]. 中国现代应用药学, 2017,34(10): 1441-1446.

作者简介：裘一婧，女，主管药师 Tel: (0571)85463892 E-mail: honeyqyj@163.com*

通信作者：方玲，女，教授 Tel:(0571)87774842 E-mail: fangl@conbagroup.com

收稿日期：2017-03-22

(本文责编：蔡珊珊)